A imagem intravital nos permite observar interações fisiológicas dentro do microambiente tumoral. E usando este método, comportamentos dinâmicos específicos que são observados podem ser compartimentados usando características de tecido local. Este protocolo usa apenas um sinal onipresente sem rótulos de fibras de colágeno ou metabólitos autofluorescentes para segmentar o TME, minimizando assim a quantidade de manipulações para o mouse.
Este método é amplamente aplicável a qualquer sistema intravital onde a compreensão de interações dinâmicas relativas a estruturas de matriz extracelular ou estruturas vasculares é necessária. Demonstrando esse procedimento estarão Dave Inman, especialista sênior em pesquisa, e Erica Hoffmann, estudante de pós-graduação do laboratório. Comece a preparar um vidro de cobertura de janela de imagem mamária, absorvendo um vidro de cobertura redonda de 1,5 12 milímetros em 100% de etanol por 10 minutos, depois seque o vidro de cobertura sob uma lâmpada de calor e fixe o vidro na estrutura da janela de imagem mamária metálica usando adesivo de cianoacrilato.
Cure o adesivo da noite para o dia. No dia seguinte, use um cotonete encharcado de acetona para limpar a janela de imagem mamária montada do adesivo em excesso antes de submergir a janela de imagem mamária em 70% de etanol por pelo menos 10 minutos para ajudar na limpeza. Depois de secar, armazene a janela de imagem mamária limpa em uma placa de Petri estéril.
Antes de iniciar a cirurgia para implantação da janela, ferramentas cirúrgicas autoclave e superfícies higienizadas com 70% de etanol. Prepare uma mesa higienizada para a cirurgia com um cobertor aquecido coberto com um campo estéril. Coloque o cobertor de aquecimento de tal forma que a temperatura medida no topo do campo estéril seja de 40 graus Celsius.
Use iluminação a frio auxiliar e lupa para o procedimento cirúrgico. Use EPI consistindo de um jaleco de uso único estéril, mangas cirúrgicas, luvas, proteção ocular e máscara facial. Em seguida, remova a pele do rato anestesiado na quarta glândula mamária inguinal com um creme depilatório e enxágue o local cirúrgico com uma gaze estéril encharcada de água.
Em seguida, prepare o local cirúrgico depilado para cirurgia, higienizando a superfície da pele com três betadinas alternadas e esfoliantes de etanol. Quando feito, levante suavemente a pele sobre a glândula mamária número quatro usando fórceps. Uma vez que a pele é afastada da parede do corpo, remova uma seção de um milímetro da camada dérmica na ponta dos fórceps com microscisores cirúrgicos.
Sem cortar a glândula subjacente, crie uma incisão de 10 milímetros e, em seguida, libere a glândula mamária da camada dérmica com o movimento suave das fórceps. Adicione PBS para cobrir a glândula exposta. Use uma sutura trançada de seda 5-0 para criar uma sutura de corda de bolsa ao longo da periferia da abertura e, em seguida, insira uma borda da janela de imagem mamária para que a camada dérmica se envolva no entalhe receptor da janela de imagem mamária.
Ao esticar o epitélio na extremidade oposta da janela de imagem mamária, empurre a janela de imagem mamária metálica para o lugar de tal forma que a camada dérmica engaje totalmente o entalhe receptor em torno de toda a circunferência da janela de imagem mamária. Em seguida, coloque a corda da bolsa para desenhar a camada dérmica no entalhe e amarre a camada para fixar a janela. Aplique um antibiótico tópico na camada dérmica na janela de imagem mamária e monitore continuamente o mouse.
Depois de recuperar a consciência suficiente para manter a recumbência severa, abriga a janela de imagem mamária implantada do mouse separadamente em cama macia com um iglu colocado na gaiola e permite que o rato se recupere por 48 horas antes da imagem. Para a imagem, use um sistema de ar forçado definido para 30 graus Celsius. Use um aquecedor objetivo adicional para evitar a deriva no foco Z e permitir que o sistema chegue ao equilíbrio a 30 graus Celsius por pelo menos uma hora antes da imagem.
Em seguida, configure uma câmara de aquecimento no palco do microscópio. Depois de confirmar a anestesia com o método de beliscar o dedo do dedo do dedo, adicione uma pomada ocular ao mouse. Para manter a hidratação adequada, injete 0,5 mililitros de PBS subcutâneamente a cada duas horas durante a duração da sessão de imagem.
Aplique um gel à base de água em vez de água ao objetivo e limpe o lado de fora do vidro da janela de imagem mamária com um aplicador de algodão e limpador de vidro antes de transferir o mouse para o estágio de microscópio pré-aquecido. Depois de colocar o mouse no estágio do microscópio, pressione a coleira da janela de imagem mamária em um orifício receptor de 14 milímetros na inserção do palco para estabilizar as imagens e encaixar a mangueira isoflurane. Em seguida, leve o campo de imagem em foco usando os oculares do microscópio e a iluminação brightfield, observando vasculatura com fluxo sanguíneo.
Verifique a estabilidade do campo de visão. Se os artefatos de movimento respiratório estiverem presentes, aplique uma compressão suave na parte traseira da glândula com um pequeno bloco de espuma e um pedaço de fita adesiva semelhante à cintura. Após a aplicação da compressão, verifique se o fluxo sanguíneo é mantido em todo o campo de visão.
Uma vez que o mouse esteja sedado e posicionado com segurança no estágio do microscópio invertido, comece a localizar regiões de interesse. Usando uma fonte de luz direcionada à janela de imagem mamária, use os oculares do microscópio para identificar áreas potenciais para investigação. O foco deve ser ver vasculatura e fluxo sanguíneo.
Adicione e salve as posições XY no software. Quando os níveis de energia apropriados forem definidos, configure a pilha Z e observe o aparecimento de fibras abundantes de colágeno a 20 a 50 micrômetros abaixo da superfície de vidro da janela de imagem mamária. O colágeno se tornará menos prevalente à medida que o microscópio se se for mais profundo no tumor.
Os vazios da segunda geração harmônica ou SHG revelam a localização das massas tumorais. Coloque a fatia z superior abaixo da camada de células solitárias com as primeiras fibras de colágeno aparecem entre 50 e 100 mícrons. Coloque a fatia Z inferior em 250 micrômetros onde as fibras desaparecem e o sinal ruim domina.
Em seguida, repita o procedimento para todas as posições XY salvas. Uma vez definida a faixa de pilha Z, aumente o tempo de moradia para oito microssegundos e otimize as configurações de energia e detector. Otimize os níveis de energia necessários para excitar o tecido para cada experimento e usar poderes de até 90 miliwatts a 750 nanômetros ou 70 miliwatts a 890 nanômetros na abertura traseira do objetivo.
Em seguida, comece com intervalos de 10 minutos entre os pontos de coleta para a maioria dos filmes de migração intravital e ajuste os intervalos de tempo de acordo com as metas experimentais. Se forem observados sinais de fototoxicidade como sangramento celular ou aumento rápido da autofluorescência e fotobleaching excessivo, reduza a potência do laser ou aumente os intervalos de timelapse conforme as condições indicam. Para imagens de fluorescência ao longo da vida ou FLIM de NADPH, inicie a visualização e ajuste a potência do laser até que a leitura da fração constante discriminar ou CFD esteja entre 10 e 10 a sexta.
Excedendo o CFD além de 10 para o sexto resultado em acúmulo de fótons e resultados gerais ruins. Uma vez definido o nível de potência, defina o tempo de integração entre 90 e 120 segundos e inicie a coleção FLIM para adquirir fótons do campo de visão para o tempo atribuído. Um campo de visão típico dentro de um tumor mamário sem rótulos demonstrou fibras abundantes de colágeno perto da janela e uma diminuição em abundância mais profunda no tumor.
O uso da fluorescência vitalícia ou NADPH ajudou na identificação da vasculatura. Algumas regiões escuras nas imagens eram dobras tumorais ou a indagável de lóbulos tumorais adjacentes. Para identificar a vasculatura, uma imagem composta usando NDPH FLIM foi validada comparando projeções de intensidade máxima da pilha intravital antes e depois da injeção da veia da cauda do dextran fluorescente.
A análise representativa mostra a quantificação de quatro camundongos e os campos de visão. Para delinear os limites das massas tumorais sem rótulo, foi utilizada a autofluorescência NADPH. As imagens relataram as assinaturas metabólicas das células e a localização dos vasos sanguíneos.
A autofluorescência AFD também identificou os macrófagos. Com o esquema de segmentação, o tumor sem rótulos foi segmentado em compartimentos para o ninho tumoral, estroma e vasculatura utilizando apenas autofluorescência SHG e NADPH. Além disso, as fibras de estroma e colágeno também podem ser classificadas em regiões locais das fibras alinhadas.
A coisa mais importante a ser lembrada para este protocolo é garantir que o mouse esteja devidamente sedado e contido para que o campo de visão permaneça estável para imagens.
