Прижизненная визуализация позволяет наблюдать физиологические взаимодействия в микроокружении опухоли. И с помощью этого метода специфическое динамическое поведение, которое наблюдается, может быть разделено с использованием местных особенностей ткани. Этот протокол использует только вездесущий сигнал без меток от коллагеновых волокон или автофлуоресцентных метаболитов для сегментации TME, тем самым сводя к минимуму количество манипуляций с мышью.
Этот метод широко применим к любой прижизненной системе, где требуется понимание динамических взаимодействий относительно структур внеклеточного матрикса или сосудистых структур. Продемонстрировать эту процедуру будут Дэйв Инман, старший научный специалист, и Эрика Хоффманн, аспирант из лаборатории. Начните подготовку стекла для молочной визуализации, замачивая 1,5 12-миллиметровое круглое покровное стекло в 100% этаноле в течение 10 минут, затем высушите покровное стекло под тепловой лампой и закрепите стекло на металлической раме окна для визуализации молочной железы с помощью цианоакрилатного клея.
Отверните клей в течение ночи. На следующий день используйте пропитанный ацетоном тампон, чтобы очистить собранное окно визуализации молочной железы от избытка клея, прежде чем погружать окно визуализации молочной железы в 70% этанол в течение не менее 10 минут, чтобы помочь с очисткой. После высыхания храните очищенное окно для визуализации молочной железы в стерильной чашке Петри.
Перед началом операции по имплантации окна автоклавные хирургические инструменты и дезинфицируют поверхности 70% этанолом. Подготовьте продезинфицированную столешницу для операции согревающим одеялом, покрытым стерильным полем. Установите согревающее одеяло таким образом, чтобы температура, измеренная поверх стерильного поля, составляла 40 градусов по Цельсию.
Используйте вспомогательное холодное освещение и увеличительные стекла для хирургической процедуры. Носите СИЗ, состоящие из стерильного одноразового лабораторного халата, хирургических рукавов, перчаток, защиты глаз и маски для лица. Далее удалить мех обезболенной мыши на четвертой паховой молочной железе кремом для депиляции и промыть место операции стерильной пропитанной водой марлей.
Затем подготовьте депилированный хирургический участок к операции, продезинфицировав поверхность кожи тремя чередующимися скрабами бетадина и этанола. Когда это будет сделано, аккуратно поднимите кожу над молочной железой номер четыре с помощью щипцов. Как только кожа будет оттянута от стенки тела, удалите один миллиметровый участок кожного слоя на кончике щипцов хирургическими микросублицаторами.
Не разрезая подлежащую железу, создайте 10-миллиметровый разрез и затем выпустите молочную железу из дермального слоя мягким движением щипцов. Добавьте PBS, чтобы покрыть открытую железу. Используйте 5-0 шелковый плетеный шов, чтобы создать шов кошельковой струны по периферии отверстия, затем вставьте край окна визуализации молочной железы так, чтобы кожный слой зацеплялся в приемную выемку окна визуализации молочной железы.
Растягивая эпителий на противоположном конце окна визуализации молочной железы, подтолкните металлическое окно визуализации молочной железы на место, чтобы дермальный слой полностью задействовал приемную выемку вокруг всей окружности окна визуализации молочной железы. Затем зажмите нить кошелька, чтобы втянуть дермальный слой в выемку и отвязать слой, чтобы закрепить окно. Нанесите местный антибиотик на кожный слой в окне визуализации молочной железы и постоянно контролируйте мышь.
После восстановления достаточного сознания для поддержания стернальной лежачих мышц поместите окно визуализации молочной железы, имплантированное мыши отдельно на мягкую подстилку с иглу, помещенным в клетку, и позвольте мыши восстановиться в течение 48 часов до визуализации. Для визуализации используйте систему принудительного воздуха, установленную на 30 градусов цельсия. Используйте дополнительный объективный нагреватель, чтобы избежать дрейфа в Z-фокусе и позволить системе прийти к равновесию при 30 градусах Цельсия в течение по крайней мере одного часа до визуализации.
Затем установите нагревательную камеру на сцене микроскопа. После подтверждения анестезии методом защемления пальца ноги добавьте мыши глазную мазь. Для поддержания надлежащей гидратации вводите 0,5 миллилитра PBS подкожно каждые два часа в течение всего сеанса визуализации.
Нанесите гель на водной основе вместо воды на цель и очистите внешнюю сторону оконного стекла молочной железы с помощью хлопкового аппликатора и очистителя стекла перед переносом мыши на предварительно нагретую стадию микроскопа. После укладки мыши на ступень микроскопа нажмите на воротник окна визуализации молочной железы в 14-миллиметровое приемное отверстие в сценической вставке, чтобы стабилизировать изображения и подогнать шланг изофлурана. Затем сфокусируйте поле визуализации с помощью микроскопа и подсветки Брайтфилда, наблюдая за сосудистой системой с кровотоком.
Проверьте стабильность поля зрения. Если присутствуют артефакты дыхательного движения, нанесите мягкое сжатие на заднюю сторону железы с помощью небольшого пеноблока и куска клейкой ленты. После применения компрессии убедитесь, что кровоток поддерживается по всему полю зрения.
Как только мышь будет успокоена и надежно расположена на сцене перевернутого микроскопа, начните находить интересующие области. Используя источник света, направленный на окно визуализации молочной железы, используйте окуляры микроскопа для определения потенциальных областей для исследования. Основное внимание должно быть сосредоточено на наблюдении сосудистой системы и кровотока.
Добавьте и сохраните позиции XY в программном обеспечении. Когда соответствующие уровни мощности установлены, настройте стек Z и наблюдайте за появлением обильных коллагеновых волокон на расстоянии от 20 до 50 микрометров под стеклянной поверхностью окна визуализации молочной железы. Коллаген станет менее распространенным, поскольку микроскоп глубже проникает в опухоль.
Пустоты второго гармонического поколения или SHG выявляют расположение опухолевых масс. Установите верхний Z-срез под слоем одиночных клеток, при этом первые коллагеновые волокна появляются на уровне от 50 до 100 микрон. Установите нижний Z-срез на 250 микрометров, где волокна исчезают и доминирует плохой сигнал.
Затем повторите процедуру для всех сохраненных позиций XY. После установки диапазона стека Z увеличьте время ожидания до восьми микросекунд и оптимизируйте мощность и настройки детектора. Оптимизируйте уровни мощности, необходимые для возбуждения ткани для каждого эксперимента, и используйте мощность до 90 милливатт на 750 нанометрах или 70 милливатт на 890 нанометрах на задней апертуре объектива.
Затем начните с 10-минутных интервалов между точками сбора для большинства фильмов о прижизненной миграции и скорректируйте временные интервалы в соответствии с экспериментальными целями. Если наблюдаются признаки фототоксичности, такие как блеббинг клеток или быстро увеличивающаяся автофлуоресценция и чрезмерное фотоотбеливание, уменьшите мощность лазера или увеличьте интервалы замедления, как показывают условия. Для флуоресцентной визуализации в течение срока службы или FLIM NADPH начните предварительное сканирование и отрегулируйте мощность лазера до тех пор, пока считывание постоянной фракции дискриминатора или CFD не составит от 10 до пятого и от 10 до шестого.
Превышение CFD выше 10 до шестого приводит к накоплению фотонов и плохим общим результатам. После установки уровня мощности установите время интеграции от 90 до 120 секунд и запустите коллекцию FLIM для получения фотонов из поля зрения в течение отведенного времени. Типичное поле зрения в опухоли молочной железы без меток продемонстрировало обильные коллагеновые волокна возле окна и уменьшение изобилия глубже в опухоль.
Использование флуоресцентного времени жизни или NADPH помогло в идентификации сосудистой системы. Некоторые темные области на изображениях представляли собой опухолевые складки или стыковку соседних долей опухоли. Чтобы идентифицировать сосудистую систему, составное изображение с использованием NDPH FLIM было проверено путем сравнения проекций максимальной интенсивности прижизненного стека до и после инъекции флуоресцентного декстрана в хвостовую вену.
Репрезентативный анализ показывает количественную оценку четырех мышей и полей зрения. Для очерчивания границ безметичных опухолевых масс использовалась автофлуоресценция NADPH. Изображения сообщали о метаболических сигнатурах клеток и расположении кровеносных сосудов.
Автофлуоресценция AFD также идентифицировала макрофаги. Со схемой сегментации опухоль без меток была сегментирована на компартменты для опухолевого гнезда, стромы и сосудистой системы с использованием только автофлуоресценции SHG и NADPH. Кроме того, волокна стромы и коллагена также могут быть классифицированы по локальным областям выровненных волокон.
Самое главное, что нужно помнить для этого протокола, это убедиться, что мышь правильно успокаивается и удерживается, чтобы поле зрения оставалось стабильным для визуализации.
