İntravital görüntüleme, tümör mikroçevresi içindeki fizyolojik etkileşimleri gözlemlememizi sağlar. Ve bu yöntem kullanılarak, gözlemlenen spesifik dinamik davranışlar lokal doku özellikleri kullanılarak bölümlere ayrılabilir. Bu protokol, TME'yi segmentlere ayırmak için kollajen liflerinden veya otofloresan metabolitlerden yalnızca her yerde bulunan etiketsiz bir sinyal kullanır, böylece fareye yapılan manipülasyon miktarını en aza indirir.
Bu yöntem, hücre dışı matriks yapılarına veya vasküler yapılara göre dinamik etkileşimleri anlamanın gerekli olduğu herhangi bir intravital sisteme geniş ölçüde uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren, kıdemli araştırma uzmanı Dave Inman ve laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi Erica Hoffmann olacak. 1,5 12 milimetrelik yuvarlak kapak camını 10 dakika boyunca% 100 etanol içine batırarak bir meme görüntüleme penceresi kapağı camı hazırlamaya başlayın, ardından kapak camını bir ısı lambası altında kurutun ve camı siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak metal meme görüntüleme penceresi çerçevesine sabitleyin.
Yapıştırıcıyı gece boyunca kürleyin. Ertesi gün, temizlemeye yardımcı olmak için meme görüntüleme penceresini en az 10 dakika boyunca% 70 etanol içine batırmadan önce, fazla yapıştırıcının monte edilmiş meme görüntüleme penceresini temizlemek için asetonla ıslatılmış bir çubuk kullanın. Kuruduktan sonra, temizlenmiş meme görüntüleme penceresini steril bir Petri kabında saklayın.
Pencere implantasyonu için ameliyata başlamadan önce, otoklav cerrahi aletleri ve yüzeyleri% 70 etanol ile sterilize edin. Steril bir alanla kaplı bir ısınma battaniyesi ile ameliyat için sterilize edilmiş bir masa üstü hazırlayın. Isınma battaniyesini, steril alanın üstünde ölçülen sıcaklık 40 santigrat derece olacak şekilde ayarlayın.
Cerrahi prosedür için yardımcı soğuk aydınlatma ve büyüteçler kullanın. Steril tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, cerrahi kılıflar, eldivenler, göz koruması ve yüz maskesinden oluşan KKD giyin. Daha sonra, anestezi uygulanan farenin kürkünü dördüncü kasık meme bezinde tüy dökücü bir kremle çıkarın ve cerrahi bölgeyi steril suya batırılmış bir gazlı bezle durulayın.
Daha sonra cilt yüzeyini üç alternatif Betadine ve etanol ovma ile sterilize ederek epilasyonlu cerrahi bölgeyi ameliyat için hazırlayın. İşiniz bittiğinde, forseps kullanarak cildi dört numaralı meme bezinin üzerine nazikçe kaldırın. Cilt vücut duvarından çekildikten sonra, forsepslerin ucundaki dermal tabakanın bir milimetrelik bir bölümünü cerrahi mikromakasla çıkarın.
Altta yatan bezi kesmeden, 10 milimetrelik bir kesi oluşturun ve daha sonra forsepslerin nazik hareketi ile meme bezini dermal tabakadan serbest bırakın. Açıkta kalan bezi örtmek için PBS ekleyin. Açıklığın çevresi boyunca bir çanta ipi dikişi oluşturmak için 5-0 ipek örgülü bir dikiş kullanın, ardından meme görüntüleme penceresinin bir kenarını yerleştirin, böylece dermal tabaka meme görüntüleme penceresinin alıcı çentiğine girer.
Meme görüntüleme penceresinin karşı ucundaki epiteli gererken, metal meme görüntüleme penceresini yerine itin, böylece dermal tabaka alıcı çentiği tüm meme görüntüleme penceresi çevresine tam olarak oturtur. Ardından, dermal tabakayı çentiğin içine çekmek için çanta ipini sıkıştırın ve pencereyi sabitlemek için katmanı bağlayın. Meme görüntüleme penceresindeki dermal tabakaya topikal bir antibiyotik uygulayın ve fareyi sürekli izleyin.
Sternal yatışmayı korumak için yeterli bilinci yeniden kazandıktan sonra, meme görüntüleme penceresi implante edilmiş fareyi kafese yerleştirilmiş bir iglo ile yumuşak yataklara ayrı ayrı yerleştirin ve farenin görüntülemeden önce 48 saat boyunca iyileşmesine izin verin. Görüntüleme için, 30 santigrat dereceye ayarlanmış bir cebri hava sistemi kullanın. Z odağında kaymayı önlemek için ek bir objektif ısıtıcı kullanın ve görüntülemeden önce sistemin en az bir saat boyunca 30 santigrat derecede dengeye gelmesine izin verin.
Daha sonra mikroskop aşamasında bir ısıtma odası kurun. Anesteziyi ayak parmağı çimdikleme yöntemiyle onayladıktan sonra, fareye bir göz merhemi ekleyin. Uygun hidrasyonu korumak için, görüntüleme seansı boyunca her iki saatte bir deri altından 0.5 mililitre PBS enjekte edin.
Hedefe su yerine su bazlı bir jel uygulayın ve fareyi önceden ısıtılmış mikroskop aşamasına aktarmadan önce meme görüntüleme penceresi camının dışını pamuklu bir aplikatör ve cam temizleyici ile temizleyin. Fareyi mikroskop aşamasına yerleştirdikten sonra, görüntüleri stabilize etmek ve izofluran hortumuna sığdırmak için meme görüntüleme penceresinin yakasını sahne ekindeki 14 milimetrelik bir alma deliğine bastırın. Ardından, mikroskop okülerlerini ve Brightfield aydınlatmasını kullanarak görüntüleme alanını odaklayın ve vaskülatürü kan akışıyla gözlemleyin.
Görüş alanının kararlılığını kontrol edin. Solunum hareketi artefaktları varsa, bezin arka tarafına küçük bir köpük blok ve cincture benzeri bir yapışkan bant parçası ile nazik bir sıkıştırma uygulayın. Sıkıştırma uygulandıktan sonra, görüş alanı boyunca kan akışının korunduğunu doğrulayın.
Fare sakinleştirildikten ve ters çevrilmiş mikroskop aşamasına güvenli bir şekilde yerleştirildikten sonra, ilgilenilen bölgeleri bulmaya başlayın. Meme görüntüleme penceresine yönlendirilmiş bir ışık kaynağı kullanarak, araştırma için potansiyel alanları tanımlamak için mikroskopun okülerlerini kullanın. Odak noktası vaskülatür ve kan akışını görmek olmalıdır.
Yazılımdaki XY konumlarını ekleyin ve kaydedin. Uygun güç seviyeleri ayarlandığında, Z yığınını kurun ve meme görüntüleme penceresinin cam yüzeyinin altında 20 ila 50 mikrometre mesafede bol miktarda kollajen lifinin görünümünü gözlemleyin. Kollajen, mikroskop tümörün derinliklerine indikçe daha az yaygın hale gelecektir.
İkinci harmonik jenerasyon veya SHG'deki boşluklar tümör kitlelerinin yerini ortaya çıkarır. Üst Z dilimini yalnız hücre tabakasının altına yerleştirin, ilk kollajen lifleri 50 ila 100 mikronda görünür. Alt Z dilimini, liflerin solduğu ve zayıf sinyalin hakim olduğu 250 mikrometreye ayarlayın.
Ardından, kaydedilen tüm XY pozisyonları için prosedürü tekrarlayın. Z yığını aralığı ayarlandıktan sonra, bekleme süresini sekiz mikrosaniyeye çıkarın ve güç ve dedektör ayarlarını optimize edin. Her deney için dokuyu uyarmak için gereken güç seviyelerini optimize edin ve hedefin arka açıklığında 750 nanometrede 90 miliwatt'a veya 890 nanometrede 70 miliwatt'a kadar olan güçleri kullanın.
Ardından, çoğu intravital göç filmi için toplama noktaları arasında 10 dakikalık aralıklarla başlayın ve zaman aralıklarını deneysel hedeflere göre ayarlayın. Hücre ağartması veya hızla artan otofloresan ve aşırı fotobeyazlatma gibi fototoksisite belirtileri gözlenirse, koşulların gösterdiği gibi lazer gücünü azaltın veya zaman atlama aralıklarını artırın. Floresan ömür boyu görüntüleme veya NADPH'nin FLIM'si için, önizleme taramasına başlayın ve sabit fraksiyon ayırıcısının veya CFD'nin okunması 10 ila beşinci ve 10 ila altıncı arasında olana kadar lazer gücünü ayarlayın.
CFD'yi 10'dan altıncıya kadar aşmak, foton yığılmasına ve genel sonuçların kötü olmasına neden olur. Güç seviyesi ayarlandıktan sonra, entegrasyon süresini 90 ila 120 saniye arasında ayarlayın ve ayrılan süre boyunca görüş alanından fotonlar almak için FLIM koleksiyonunu başlatın. Etiketsiz bir meme tümörü içindeki tipik bir görüş alanı, pencerenin yakınında bol miktarda kollajen lifi ve tümörün derinliklerinde bollukta bir azalma olduğunu göstermiştir.
Floresan ömrü veya NADPH kullanımı vaskülatürün tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Görüntülerdeki bazı karanlık bölgeler tümör kıvrımları veya bitişik tümör loblarının poposu idi. Vaskülatürü tanımlamak için, NDPH FLIM kullanan kompozit bir görüntü, floresan dekstranın kuyruk damarı enjeksiyonundan önce ve sonra intravital yığının maksimum yoğunluk projeksiyonlarını karşılaştırarak doğrulandı.
Temsili analiz, dört farenin miktarını ve görüş alanlarını gösterir. Etiketsiz tümör kitlelerinin sınırlarını belirlemek için NADPH otofloresan kullanıldı. Görüntüler, hücrelerin metabolik imzalarını ve kan damarlarının yerini bildirdi.
AFD otofloresansı makrofajları da tanımladı. Segmentasyon şeması ile, etiketsiz tümör sadece SHG ve NADPH otofloresan kullanılarak tümör yuvası, stroma ve vaskülatür için bölmelere bölündü. Ek olarak, stroma ve kollajen lifleri, hizalanmış liflerin yerel bölgelerine de sınıflandırılabilir.
Bu protokol için hatırlanması gereken en önemli şey, görüş alanının görüntüleme için sabit kalması için farenin uygun şekilde sakinleştirildiğinden ve kısıtlandığından emin olmaktır.
