Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Die intravitale Bildgebung ermöglicht es uns, physiologische Wechselwirkungen innerhalb der Tumormikroumgebung zu beobachten. Und durch die Verwendung dieser Methode können spezifische dynamische Verhaltensweisen, die beobachtet werden, unter Verwendung lokaler Gewebemerkmale unterteilt werden. Dieses Protokoll verwendet nur ein allgegenwärtiges markierungsfreies Signal von Kollagenfasern oder autofluoreszierenden Metaboliten, um die TME zu segmentieren, wodurch die Anzahl der Manipulationen an der Maus minimiert wird.

Diese Methode ist weitgehend auf jedes intravitale System anwendbar, in dem das Verständnis dynamischer Wechselwirkungen in Bezug auf extrazelluläre Matrixstrukturen oder Gefäßstrukturen erforderlich ist. Dave Inman, Senior Research Specialist, und Erica Hoffmann, eine Doktorandin aus dem Labor, werden dieses Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Brustbildfenster-Deckglases, indem Sie ein 1,5 12 Millimeter langes rundes Deckglas 10% Ethanol für 10 Minuten einweichen, dann das Deckglas unter einer Wärmelampe trocknen und das Glas mit Cyanacrylat-Klebstoff am Metall-Brustbild-Fensterrahmen befestigen.

Härten Sie den Klebstoff über Nacht aus. Verwenden Sie am nächsten Tag einen mit Aceton getränkten Tupfer, um das zusammengebaute Brustbildgebungsfenster von dem überschüssigen Klebstoff zu reinigen, bevor Sie das Brustbildgebungsfenster mindestens 10 Minuten lang in 70% Ethanol tauchen, um die Reinigung zu unterstützen. Nach dem Trocknen das gereinigte Brustbildfenster in einer sterilen Petrischale aufbewahren.

Bevor Sie mit der Operation für die Fensterimplantation beginnen, autoklavieren Sie chirurgische Werkzeuge und desinfizieren Sie Oberflächen mit 70% Ethanol. Bereiten Sie eine desinfizierte Tischplatte für die Operation mit einer wärmenden Decke vor, die mit einem sterilen Feld bedeckt ist. Stellen Sie die Wärmedecke so ein, dass die Temperatur, die oben auf dem sterilen Feld gemessen wird, 40 Grad Celsius beträgt.

Verwenden Sie für den chirurgischen Eingriff eine zusätzliche Kältebeleuchtung und Lupen. Tragen Sie eine PSA, die aus einem sterilen Einweg-Laborkittel, chirurgischen Hüllen, Handschuhen, Augenschutz und Gesichtsmaske besteht. Als nächstes entfernen Sie das Fell der betäubten Maus an der vierten Leistenbrust mit einer Enthaarungscreme und spülen Sie die Operationsstelle mit einer sterilen wassergetränkten Gaze ab.

Bereiten Sie dann die enthaarte Operationsstelle für die Operation vor, indem Sie die Hautoberfläche mit drei abwechselnden Betadin- und Ethanolpeelings desinisieren. Wenn Sie fertig sind, heben Sie die Haut sanft über die Brustdrüse Nummer vier mit einer Pinzette an. Sobald die Haut von der Körperwand weggezogen ist, entfernen Sie einen Millimeter Abschnitt der Hautschicht an der Spitze der Pinzette mit einer chirurgischen Mikroschere.

Ohne die darunter liegende Drüse zu schneiden, erstellen Sie einen 10-Millimeter-Schnitt und lösen Sie dann die Brustdrüse mit der sanften Bewegung der Pinzette aus der Hautschicht. Fügen Sie PBS hinzu, um die freiliegende Drüse abzudecken. Verwenden Sie eine 5-0 Seidengeflechtnaht, um eine Handtuchsaitennaht entlang der Peripherie der Öffnung zu erstellen, und setzen Sie dann eine Kante des Brustbildgebungsfensters ein, so dass die Hautschicht in die Empfangskerbe des Brustbildgebungsfensters eingreift.

Während Sie das Epithel am gegenüberliegenden Ende des Brustbildgebungsfensters dehnen, drücken Sie das Brustbildgebungsfenster aus Metall an seinen Platz, so dass die Hautschicht die empfangende Kerbe um den gesamten Umfang des Brustbildgebungsfensters vollständig einrastet. Ziehen Sie dann die Geldbörsenschnur zusammen, um die Hautschicht in die Kerbe zu ziehen, und binden Sie die Schicht ab, um das Fenster zu sichern. Tragen Sie ein topisches Antibiotikum auf die Hautschicht am Brustbildgebungsfenster auf und überwachen Sie die Maus kontinuierlich.

Nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, um die sternale Liegefähigkeit aufrechtzuerhalten, legen Sie die implantierte Maus separat auf weicher Bettwäsche mit einem Iglu im Käfig unter, und lassen Sie die Maus 48 Stunden vor der Bildgebung genesen. Verwenden Sie für die Bildgebung ein auf 30 Grad Celsius eingestelltes Zwangsluftsystem. Verwenden Sie eine zusätzliche Objektivheizung, um Drift im Z-Fokus zu vermeiden und das System vor der Bildgebung mindestens eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius ins Gleichgewicht zu bringen.

Stellen Sie dann eine Heizkammer auf der Mikroskopstufe auf. Nachdem Sie die Anästhesie mit der Zehenquetschmethode bestätigt haben, fügen Sie der Maus eine Augensalbe hinzu. Um die richtige Hydratation aufrechtzuerhalten, injizieren Sie alle zwei Stunden für die Dauer der Bildgebungssitzung 0,5 Milliliter PBS subkutan.

Tragen Sie ein Gel auf Wasserbasis anstelle von Wasser auf das Objektiv auf und reinigen Sie die Außenseite des Brustbildfensterglases mit einem Baumwollapplikator und einem Glasreiniger, bevor Sie die Maus in die vorgewärmte Mikroskopstufe bringen. Nachdem Sie die Maus auf den Mikroskoptisch gelegt haben, drücken Sie den Kragen des Brustbildfensters in ein 14-Millimeter-Aufnahmeloch im Bühneneinsatz, um die Bilder zu stabilisieren und den Isofluranschlauch zu montieren. Bringen Sie dann das Bildgebungsfeld mit dem Mikroskop Okularen und der Hellfeldbeleuchtung in den Fokus und beobachten Sie das Gefäßsystem mit Blutfluss.

Überprüfen Sie die Stabilität des Sichtfelds. Wenn Atembewegungsartefakte vorhanden sind, tragen Sie eine sanfte Kompression auf die Rückseite der Drüse mit einem kleinen Schaumstoffblock und einem cinkturartigen Stück Klebeband auf. Überprüfen Sie nach der Komprimierung, ob der Blutfluss im gesamten Sichtfeld aufrechterhalten wird.

Sobald die Maus sediert und sicher auf der invertierten Mikroskopstufe positioniert ist, beginnen Sie mit der Suche nach interessanten Regionen. Verwenden Sie eine Lichtquelle, die auf das Brustbildgebungsfenster gerichtet ist, und verwenden Sie das Okular des Mikroskops, um potenzielle Bereiche für die Untersuchung zu identifizieren. Der Fokus sollte darauf liegen, Gefäße und Blutfluss zu sehen.

Fügen Sie die XY-Positionen in der Software hinzu und speichern Sie sie. Wenn die entsprechenden Leistungsstufen eingestellt sind, richten Sie den Z-Stack ein und beobachten Sie das Auftreten von reichlich Kollagenfasern bei 20 bis 50 Mikrometern unter der Glasoberfläche des Brustbildgebungsfensters. Kollagen wird weniger verbreitet, wenn das Mikroskop tiefer in den Tumor eindringt.

Die Hohlräume in der zweiten harmonischen Generation oder SHG zeigen die Lage der Tumormassen. Stellen Sie die obere Z-Scheibe unter die Schicht der Einzelzellen, wobei die ersten Kollagenfasern bei 50 bis 100 Mikrometern erscheinen. Stellen Sie die untere Z-Scheibe auf 250 Mikrometer ein, wo die Fasern ausblenden und das schlechte Signal dominiert.

Wiederholen Sie dann den Vorgang für alle gespeicherten XY-Positionen. Sobald der Z-Stack-Bereich eingestellt ist, erhöhen Sie die Verweilzeit auf acht Mikrosekunden und optimieren Sie die Leistungs- und Detektoreinstellungen. Optimieren Sie die Leistungsstufen, die zur Anregung des Gewebes für jedes Experiment erforderlich sind, und verwenden Sie Leistungen von bis zu 90 Milliwatt bei 750 Nanometern oder 70 Milliwatt bei 890 Nanometern an der hinteren Blende des Objektivs.

Beginnen Sie als Nächstes mit 10-Minuten-Intervallen zwischen den Sammelpunkten für die meisten intravitalen Migrationsfilme und passen Sie die Zeitintervalle entsprechend den experimentellen Zielen an. Wenn Anzeichen von Phototoxizität wie Zellblebbing oder schnell zunehmende Autofluoreszenz und übermäßiges Photobleichen beobachtet werden, reduzieren Sie die Laserleistung oder erhöhen Sie die Zeitrafferintervalle, wenn die Bedingungen dies anzeigen. Für die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung oder FLIM von NADPH starten Sie das Vorschauscannen und passen Sie die Laserleistung an, bis das Auslesen des Diskriminators oder CFD mit konstantem Anteil zwischen 10 und dem fünften und 10 bis zum sechsten liegt.

Übertreffen von CFD über 10 bis zum sechsten Ergebnis in Photonenstapelung und schlechten Gesamtergebnissen. Sobald das Leistungsniveau eingestellt ist, stellen Sie die Integrationszeit zwischen 90 und 120 Sekunden ein und starten Sie die FLIM-Sammlung, um Photonen aus dem Sichtfeld für die zugewiesene Zeit zu erfassen. Ein typisches Sichtfeld innerhalb eines markierungsfreien Brusttumors zeigte reichlich Kollagenfasern in der Nähe des Fensters und eine Abnahme der Häufigkeit tiefer in den Tumor.

Die Verwendung von Fluoreszenzlebensdauer oder NADPH half bei der Identifizierung des Gefäßsystems. Einige dunkle Regionen in den Bildern waren Tumorfalten oder das Aufstoßen benachbarter Tumorlappen. Um das Gefäßsystem zu identifizieren, wurde ein zusammengesetztes Bild mit NDPH FLIM validiert, indem die Projektionen der maximalen Intensität des intravitalen Stapels vor und nach der Injektion von fluoreszierendem Dextran in die Schwanzvene verglichen wurden.

Die repräsentative Analyse zeigt die Quantifizierung von vier Mäusen und den Sichtfeldern. Um die Grenzen der markierungsfreien Tumormassen abzugrenzen, wurde die NADPH-Autofluoreszenz verwendet. Die Bilder berichteten über die metabolischen Signaturen der Zellen und die Lage der Blutgefäße.

Die AFD-Autofluoreszenz identifizierte auch die Makrophagen. Mit dem Segmentierungsschema wurde der markierungsfreie Tumor in Kompartimente für das Tumornest, das Stroma und die Gefäße unterteilt, wobei nur SHG- und NADPH-Autofluoreszenz verwendet wurden. Zusätzlich können die Stroma- und Kollagenfasern auch in lokale Bereiche der ausgerichteten Fasern eingeteilt werden.

Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Protokoll erinnern sollten, ist sicherzustellen, dass die Maus ordnungsgemäß sediert und zurückgehalten wird, damit das Sichtfeld für die Bildgebung stabil bleibt.