سنوضح لك كيفية تحضير السمان الياباني خارج ثقافة البيض وكيفية استخدام غشاء chorioallantoic أو CAM باختصار للتشخيص الضوئي الديناميكي وعلاج السرطان أو الالتهابات الميكروبية. مزايا هذه الطريقة هي النمو التنموي السريع ، وصغر الحجم ، والوصول الجيد إلى الأنسجة ، وسهولة التعامل. أيضا ، فإنه يحترم مبادئ قاعدة 3R لإجراء البحوث على الحيوانات.
نظرا لتشابهه الهيكلي مع الأغشية المخاطية مثل المثانة أو الرئتين أو المشيمة ، فهو مناسب لاختبار الأدوية المحتملة في الجسم الحي أو اختبار السمية أو دراسات الزرع. ستوضح الإجراء باربورا كونديكوفا وماجليندا ميتا ، طالبتا الدكتوراه من مختبري. للبدء ، استخدم بيض السمان المخصب ، طازجا أو مخزنا في 10 إلى 15 درجة مئوية لمدة أقصاها 4 إلى 5 أيام قبل بدء الحضانة.
استخدم البيض النظيف وغير التالف فقط ، ثم احتضن البيض في حاضنة قسرية عند رطوبة 50 إلى 60٪ و 37.5 درجة مئوية لمدة 54 ساعة تقريبا توضع أفقيا مع إيقاف دوران البيض. تطهير سطح البيض مع 70 ٪ من الإيثانول دون تدوير البيضة. بعد ذلك ، في خزانة تدفق صفائحية معقمة أثناء ارتداء القفازات ، افتح قشر البيض باستخدام مقص جراحي صغير معقم وانقل المحتوى إلى لوحة ثقافة من 6 آبار.
بعد كل بيضة ، قم بتطهير المقص بنسبة 70٪ من الإيثانول. أضف ما يقرب من 5 ملليلتر من الماء المعقم إلى الفجوات الموجودة في الصفيحة المكونة من 6 آبار لأن الرطوبة ضرورية لمنع CAM من الجفاف. بعد ذلك ، قم بشفط الأجنة ذات الرؤوس غير الصحيحة أو البيض غير المخصب باستخدام شفاط فراغي ، ثم ضع الأجنة في حاضنة حتى إجراء المزيد من التجارب مع الحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية في رطوبة تتراوح بين 80 و 90٪.
عندما يتم تطوير CAM بما فيه الكفاية ، عادة من اليوم الجنيني 7 ، ضع حلقة سيليكون معقمة على سطح CAM على طول الشعيرات الدموية الصغيرة مع تجنب الأوعية الدموية الرئيسية. في ظل ظروف معقمة ، ضع حجما مناسبا من محلول hypericin 30 ميكرولتر على حلقة السيليكون واحتفظ بالأجنة في حاضنة عند 37 درجة مئوية في رطوبة 80 إلى 90٪. لإجراء التشخيص الضوئي الديناميكي ، قم بإضاءة CAM باستخدام ضوء الإثارة البنفسجي وتسجيل تألق أنسجة hypericin و CAM والخلايا السرطانية باستخدام كاميرا رقمية على فترات زمنية مختلفة بعد إعطاء hypericin.
إذا كان البحث يتطلب صورة ل CAM في الضوء الأبيض ، فقم بتسجيل CAM قبل إعطاء hypericin وفي نهاية التجربة قبل وقت قصير من تثبيت الأنسجة ، حيث يؤدي الضوء إلى تنشيط صورة hypericin. لإجراء العلاج الضوئي الديناميكي بعد تطبيق hypericin ، ضع CAM تحت الألياف البصرية لشعاع الليزر لتغطية المنطقة بأكملها داخل حلقة السيليكون. بعد إجراء التشعيع في الجسم الحي ، في هذه الحالة بالذات باستخدام ضوء ليزر 405 نانومتر بمعدل طلاقة يبلغ 285 مللي واط لكل سنتيمتر مربع ، سجل CAM باستخدام الضوء الأبيض و / أو ضوء الفلورسنت قبل وبعد المعالجة الضوئية الديناميكية.
إصلاح الأنسجة CAM في لوحة زراعة مع 4 ٪ paraformaldehyde في PBS لمدة لا تقل عن 2 ساعة وبحد أقصى بين عشية وضحاها ، ثم إزالة paraformaldehyde وقطع بعناية من CAM جزء من الأنسجة داخل حلقة السيليكون. يجب أن تتم كل هذه الخطوات في غطاء الدخان. اغسل جزءا مقطوعا من نسيج CAM في الماء لمدة 10 دقائق ثم جففه في سلسلة الكحول الصاعدة عن طريق وضع نسيج CAM في 70٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق ، ومحلول الإيوسين لمدة دقيقتين ، والثروسين 96٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق ، والإيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق ، ومرتين في الزيلين لمدة 10 دقائق في طبق بتري جديد.
بعد ذلك ، انقل العينات في أسرع وقت ممكن إلى البارافين المذاب في أطباق بتري باستخدام ملعقة أو فرشاة رقيقة. بعد 24 ساعة ، ضع الأنسجة في قالب نسيجي ، واملأها بوسط تضمين البارافين واتركها تتصلب في الثلاجة ، ثم اقطع CAM المتصلب من وسط التضمين ، وقلبه في الدرج بمقدار 90 درجة ، واملأه مرة أخرى بوسط التضمين واتركه يتصلب. قم بإعداد 5 إلى 10 أقسام ميكرومتر على ميكروتوم للتحليل النسيجي المرضي لتحديد الضرر الناجم عن PDT.
لإعداد أقسام CAM المجمدة لعلم الأنسجة ، قم بتركيب CAM الأصلي أو 4٪ paraformaldehyde الثابت بعناية على الشريحة الزجاجية ، واملأ قالب التضمين إلى النصف ب OCT وقم بتجميده في النيتروجين السائل أو خليط من الثلج الجاف والإيثانول. بعد التجميد ، قم بإمالة CAM بعناية وتحريكها من الشريحة الزجاجية إلى الجزء العلوي من وسط OCT المجمد. ضع مرة أخرى في القالب ، وقم بتغطيته بوسط OCT وقم بتجميده كما هو موضح سابقا.
لتحليل الأوعية الدموية CAM ، هناك حاجة إلى عينات CAM كاملة. في خزانة التدفق الرقائقي ، تفيض CAM بمحلول تثبيت مسبق الاحترار من 4٪ من ألدهيد بارافورم ، و 2٪ glutaraldehyde في PBS ، ثم قم بإزالة محلول التثبيت بعد 48 ساعة. بعد ذلك ، افصل CAM بعناية عن الجنين باستخدام مقص دقيق وفرشاة دقيقة واغسله في PBS ، ثم قم بتركيب CAM المغسول على شريحة زجاجية واتركه يجف ببطء.
بعد ذلك، قم بتصوير الشريحة باستخدام كاميرا رقمية في جهاز تحويل كمصدر للضوء الأبيض المتجانس. تم تصور موقع الورم على سطح CAM تحت الضوء الأبيض وضوء الفلورسنت عند إضافة hypericin. أظهر التحليل النسيجي هياكل متحدة المركز للخلايا الحرشفية غير الطبيعية التي تغزو الأنسجة السليمة مصحوبة بالوذمة وسماكة الغشاء.
بعد العلاج باستخدام PDT ، لوحظ اختلاف واضح في كثافة الأوعية داخل الحلقة والمنطقة المحيطة بها. لم يسبب إشعاع الليزر دون وجود محسس للضوء أي ضرر مماثل للتحكم دون أي علاج. بعد 3 ساعات من الحضانة مع hypericin ، أدى تشعيع الليزر إلى التألق الناجم عن مونوميرات hypericin المجمعة مع أضرار جسيمة في الأوعية الدموية.
كشف التحليل النسيجي أن التحكم غير المعالج CAM كان له سمك متساو نسبيا. ومع ذلك ، تسبب علاج PDT في أن يصبح CAM أرق وأكثر هشاشة. لقد أوضحنا للتو كيفية تحضير فحص CAM للسمان ex ovo وكيفية استخدامه.
مع الحفاظ على المبادئ التوجيهية ، من السهل إتقان هذه المنهجية ويمكن أن تثبت نتائج سريعة.
