Wir zeigen Ihnen, wie Sie die japanische Wachtelkultur ex ovo vorbereiten und wie Sie Chorioallantoic Membran oder kurz CAM für die photodynamische Diagnose und Therapie von Krebs oder mikrobiellen Infektionen einsetzen. Vorteile dieser Methode sind schnelles Entwicklungswachstum, geringe Größe, guter Zugang zum Gewebe und einfache Handhabung. Außerdem respektiert es die Grundsätze der 3R-Regel für die Durchführung von Tierversuchen.
Aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit den Schleimhäuten wie Blase, Lunge oder Plazenta eignet es sich für In-vivo-Tests potenzieller Medikamente, Toxizitätstests oder Transplantationsstudien. Barbora Kundekova und Majlinda Meta, Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Verwenden Sie zunächst befruchtete Wachteleier, frisch oder bei 10 bis 15 Grad Celsius für maximal 4 bis 5 Tage vor Beginn der Inkubation gelagert.
Verwenden Sie nur saubere und unbeschädigte Eier und brüten Sie die Eier dann in einem Inkubator mit Zwangszug bei 50 bis 60% Feuchtigkeit und 37,5 Grad Celsius für ca. 54 Stunden horizontal mit ausgeschalteten Eierrotationen aus. Desinfizieren Sie die Eioberfläche mit 70% Ethanol, ohne das Ei zu drehen. Als nächstes öffnen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Schrank mit Handschuhen die Eierschale mit einer kleinen sterilen chirurgischen Schere und geben Sie den Inhalt in eine 6-Well-Kulturplatte.
Desinfizieren Sie die Schere nach jedem Ei mit 70% Ethanol. Fügen Sie etwa 5 Milliliter steriles Wasser in die Lücken in der 6-Well-Platte hinzu, da Feuchtigkeit unerlässlich ist, um ein Austrocknen des CAM zu verhindern. Als nächstes saugen Sie unsachgemäß bestückte Embryonen oder unbefruchtete Eier mit einem Vakuumsauger ab und legen Sie die Embryonen bis zu weiteren Experimenten in einen Inkubator, während Sie eine Temperatur von 37 Grad Celsius bei 80 bis 90% Luftfeuchtigkeit beibehalten.
Wenn die CAM ausreichend entwickelt ist, normalerweise ab dem 7. Tag des Embryonals, legen Sie einen sterilisierten Silikonring entlang der kleinen Kapillaren auf die CAM-Oberfläche und vermeiden Sie dabei größere Blutgefäße. Unter sterilen Bedingungen ein geeignetes Volumen Hypericinlösung von 30 Mikrolitern auf den Silikonring auftragen und die Embryonen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius bei 80 bis 90% Luftfeuchtigkeit aufbewahren. Zur photodynamischen Diagnostik beleuchten Sie das CAM mit violettem Anregungslicht und erfassen die Fluoreszenz von Hypericin und CAM-Gewebe und Tumorzellen mit einer Digitalkamera in unterschiedlichen Zeitintervallen nach Hypericin-Verabreichung.
Wenn die Forschung ein Bild der CAM in weißem Licht erfordert, zeichnen Sie die CAM vor der Hypericin-Verabreichung und am Ende des Experiments kurz vor der Gewebefixierung auf, da das Licht die Photoaktivierung von Hypericin auslöst. Um die photodynamische Therapie nach der Hypericin-Anwendung durchzuführen, legen Sie das CAM unter die optische Faser, damit der Laserstrahl den gesamten Bereich innerhalb des Silikonrings abdeckt. Nach der In-vivo-Bestrahlung, in diesem speziellen Fall mit einem 405-Nanometer-Laserlicht mit einer Fluenzrate von 285 Milliwatt pro Quadratzentimeter, wird CAM mit weißem Licht und/oder Fluoreszenzlicht vor und nach der photodynamischen Behandlung aufgenommen.
Fixieren Sie das CAM-Gewebe in einer Kultivierungsplatte mit 4% Paraformaldehyd in PBS für mindestens 2 Stunden und maximal über Nacht, entfernen Sie dann das Paraformaldehyd und schneiden Sie vorsichtig einen Teil des Gewebes innerhalb des Silikonrings aus dem CAM aus. Alle diese Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Waschen Sie den geschnittenen Teil aus dem CAM-Gewebe 10 Minuten lang in Wasser und dehydrieren Sie anschließend in aufsteigender Alkoholreihe, indem Sie das CAM-Gewebe für 3 Minuten in 70% Ethanol, Eosinlösung für 2 Minuten, Throcin 96% Ethanol für 5 Minuten, 100% Ethanol für 5 Minuten und zweimal in Xylol für 10 Minuten in eine neue Petrischale geben.
Anschließend werden die Proben so schnell wie möglich mit einem Spatel oder einer dünnen Bürste in das gelöste Paraffin in Petrischalen überführt. Nach 24 Stunden das Gewebe in eine histologische Form geben, mit einem Paraffin-Einbettmedium füllen und im Kühlschrank erstarren lassen, dann das verfestigte CAM vom Einbettmedium abschneiden, im Tablett um 90 Grad drehen, erneut mit dem Einbettmedium füllen und erstarren lassen. Bereiten Sie 5 bis 10 Mikrometer Schnitte auf einem Mikrotom für die histopathologische Analyse vor, um PDT-induzierte Schäden zu bestimmen.
Um die gefrorenen CAM-Schnitte für die Histologie vorzubereiten, montieren Sie vorsichtig natives oder 4% Paraformaldehyd-fixiertes CAM auf den Glasobjektträger, füllen Sie die Einbettungsform mit OCT zur Hälfte und frieren Sie in flüssigem Stickstoff oder einer Mischung aus Trockeneis und Ethanol ein. Nach dem Einfrieren das CAM vorsichtig kippen und schieben Sie es vom Glasobjektträger auf die Oberseite des gefrorenen OCT-Mediums. Erneut in die Form geben, mit OCT-Medium abdecken und wie zuvor beschrieben einfrieren.
Für die Analyse des CAM-Gefäßsystems werden ganze CAM-Proben benötigt. Im Laminar-Flow-Schrank CAM mit einer vorgewärmten Fixierungslösung aus 4% paraformem Aldehyd und 2% Glutaraldehyd in PBS überlaufen und dann die Fixierungslösung nach 48 Stunden entfernen. Als nächstes trennen Sie das CAM vorsichtig mit einer Mikroschere und einer feinen Bürste vom Embryo und waschen Sie es in PBS, dann montieren Sie das gewaschene CAM auf einem Glasobjektträger und lassen Sie es langsam trocknen.
Anschließend fotografieren Sie das Dia mit einer Digitalkamera in einem Transilluminator als Quelle für homogenes weißes Licht. Die Lage des Tumors auf der CAM-Oberfläche wurde unter weißem Licht und fluoreszierendem Licht unter Zugabe von Hypericin visualisiert. Die histologische Analyse zeigte konzentrische Strukturen abnormaler Plattenepithelzellen, die in das gesunde Gewebe eindringen, begleitet von Ödemen und Membranverdickungen.
Nach der Behandlung mit PDT wurde ein deutlicher Unterschied in der Gefäßdichte innerhalb des Rings und der Umgebung beobachtet. Die Laserstrahlung ohne das Vorhandensein von Photosensibilisator verursachte keinen Schaden, der mit der Kontrolle ohne Behandlung vergleichbar war. Nach 3 Stunden Inkubation mit Hypericin führte die Laserbestrahlung zu einer Fluoreszenz, die durch Monomerisierung des aggregierten Hypericins mit ausgedehnter Schädigung des Gefäßsystems verursacht wurde.
Die histologische Analyse ergab, dass unbehandeltes Kontroll-CAM eine relativ gleichmäßige Dicke aufwies. Die PDT-Behandlung führte jedoch dazu, dass die CAM dünner und zerbrechlicher wurde. Wir haben gerade gezeigt, wie man Wachtel ex ovo CAM-Assay vorbereitet und wie man es verwendet.
Unter Beibehaltung der Richtlinien ist diese Methodik leicht zu beherrschen und kann schnelle Ergebnisse nachweisen.
