Мы покажем вам, как приготовить культуру японских перепелов ex ovo и как использовать хориоаллантоидную мембрану или CAM для фотодинамической диагностики и терапии рака или микробных инфекций. Преимуществами этого метода являются быстрый рост развития, небольшие размеры, хороший доступ к тканям и простота в обращении. Кроме того, он соблюдает принципы правила 3R для проведения исследований на животных.
Из-за его структурного сходства со слизистыми оболочками, такими как мочевой пузырь, легкие или плацента, он подходит для тестирования in vivo потенциальных лекарств, тестирования токсичности или исследований трансплантации. Продемонстрировать процедуру будут Барбора Кундекова и Майлинда Мета, аспиранты из моей лаборатории. Для начала используйте оплодотворенные перепелиные яйца, свежие или хранящиеся при температуре от 10 до 15 градусов Цельсия в течение максимум 4-5 дней до начала инкубации.
Используйте только чистые и неповрежденные яйца, затем высиживайте яйца в инкубаторе с принудительной тягой при влажности от 50 до 60% и температуре 37,5 градусов Цельсия в течение примерно 54 часов, размещенных горизонтально с выключенными ротациями яиц. Продезинфицируйте поверхность яйца 70% этанолом без вращения яйца. Затем в стерильном ламинарном проточном шкафу в перчатках откройте яичную скорлупу с помощью небольших стерильных хирургических ножниц и перенесите содержимое в 6-луночную культуральную пластину.
После каждого яйца дезинфицируйте ножницы 70% этанолом. Добавьте приблизительно 5 миллилитров стерильной воды в промежутки в 6-луночной пластине, так как влажность необходима для предотвращения высыхания CAM. Затем аспирировать неправильно опрокинутые эмбрионы или неоплодотворенные яйца вакуумным аспиратором, затем поместить эмбрионы в инкубатор до дальнейших экспериментов, поддерживая температуру 37 градусов цельсия при влажности от 80 до 90%.
Когда CAM достаточно развит, обычно с эмбрионального дня 7, поместите стерилизованное силиконовое кольцо на поверхность CAM вдоль мелких капилляров, избегая крупных кровеносных сосудов. В стерильных условиях нанесите соответствующий объем раствора гиперицина 30 микролитров на силиконовое кольцо и держите эмбрионы в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия при влажности от 80 до 90%. Для проведения фотодинамической диагностики освещают КАМ с помощью фиолетового света возбуждения и регистрируют флуоресценцию гиперицина и КАМ-тканей и опухолевых клеток цифровой камерой через разные промежутки времени после введения гиперицина.
Если исследование требует изображения CAM в белом свете, запишите CAM перед введением гиперицина и в конце эксперимента незадолго до фиксации ткани, так как свет запускает фотоактивацию гиперицина. Чтобы выполнить фотодинамическую терапию после применения гиперицина, поместите CAM под оптическое волокно, чтобы лазерный луч покрыл всю область внутри силиконового кольца. После выполнения облучения in vivo, в данном конкретном случае лазерным светом 405 нанометров со скоростью флюенса 285 милливатт на квадратный сантиметр, запишите CAM с использованием белого света и / или флуоресцентного света до и после фотодинамической обработки.
Зафиксируйте ткань CAM в культивационной пластине с 4% параформальдегидом в PBS в течение минимум 2 часов и максимум на ночь, затем удалите параформальдегид и аккуратно вырежьте из CAM часть ткани внутри силиконового кольца. Все эти шаги должны быть сделаны в вытяжке. Промыть вырезанную часть из ткани CAM в воде в течение 10 минут и затем обезвоживать в восходящем спиртовом ряду, поместив ткань CAM в 70% этанол на 3 минуты, раствор эозина в течение 2 минут, троцин 96% этанол в течение 5 минут, 100% этанол в течение 5 минут и дважды в ксилол в течение 10 минут в новой чашке Петри.
Впоследствии как можно быстрее перенесите образцы на растворенный парафин в чашках Петри с помощью шпателя или тонкой щетки. Через 24 часа поместите ткань в гистологическую форму, заполните ее парафиновой встраиваемой средой и дайте ей затвердеть в холодильнике, затем вырежьте затвердевший CAM из встраиваемой среды, поверните ее в лоток на 90 градусов, снова заполните ее встраивающей средой и дайте ей затвердеть. Подготовьте от 5 до 10 микрометровых срезов на микротоме для гистопатологического анализа для определения повреждений, вызванных ФДТ.
Чтобы подготовить замороженные CAM-участки к гистологии, аккуратно смонтируйте нативный или 4%-ный параформальдегидный фиксированный CAM на стеклянной горке, заполните форму для встраивания до половины с ПОМОЩЬЮ OCT и заморозьте в жидком азоте или смеси сухого льда и этанола. После замораживания осторожно наклоните и сдвиньте CAM со стеклянного слайда на верхнюю часть замороженной среды OCT. Поместите снова в форму, накройте ее средой OCT и заморозьте, как описано ранее.
Для анализа сосудистой системы CAM необходимы целые образцы CAM. В ламинарном проточном шкафу переполняют CAM с предварительной фиксацией раствором 4%-параформного альдегида и 2%-ного глутаральдегида в PBS, затем удаляют фиксирующий раствор через 48 часов. Затем тщательно отделите CAM от эмбриона микроножными ножницами и тонкой щеткой и вымойте его в PBS, затем установите вымытый CAM на стеклянную горку и дайте ему медленно высохнуть.
После этого сфотографируйте слайд с помощью цифровой камеры в трансиллюминаторе в качестве источника однородного белого света. Расположение опухоли на поверхности CAM визуализировали под белым светом и флуоресцентным светом при добавлении гиперицина. Гистологический анализ показал концентрические структуры аномальных плоских клеток, вторгающихся в здоровые ткани, сопровождающихся отеком и утолщением мембран.
После лечения ФДТ наблюдалась четкая разница в плотности сосудов внутри кольца и прилегающей области. Лазерное излучение без присутствия фотосенсибилизатора не вызывало никаких повреждений, сравнимых с контролем без какого-либо лечения. После 3 часов инкубации с гиперицином лазерное облучение приводило к флуоресценции, вызванной мономеризацией агрегированного гиперицина с обширным повреждением сосудистой системы.
Гистологический анализ показал, что необработанный контрольный КАМ имел относительно ровную толщину. Тем не менее, лечение ФДТ привело к тому, что CAM стал тоньше и хрупче. Мы только что продемонстрировали, как приготовить перепел ex ovo CAM анализ и как его использовать.
При соблюдении руководящих принципов эта методология проста в освоении и может доказать быстрые результаты.
