Vamos mostrar-lhe como preparar a cultura japonesa de codornas ex ovo e como usar a membrana corioalantóica ou CAM em resumo para diagnóstico fotodinâmico e terapia de câncer ou infecções microbianas. As vantagens deste método são o rápido crescimento do desenvolvimento, tamanho pequeno, bom acesso ao tecido e fácil manuseio. Além disso, respeita os princípios da regra 3R para a realização de pesquisas com animais.
Devido à sua semelhança estrutural com as membranas mucosas, como a bexiga, os pulmões ou a placenta, é adequado para testes in vivo de potenciais drogas, testes de toxicidade ou estudos de transplante. Demonstrando o procedimento estarão Barbora Kundekova e Majlinda Meta, estudantes de doutorado do meu laboratório. Para começar, use ovos de codorna fertilizados, frescos ou armazenados a 10 a 15 graus Celsius por um máximo de 4 a 5 dias antes do início da incubação.
Use apenas ovos limpos e não danificados, em seguida, incube os ovos em uma incubadora de tração forçada a 50 a 60% de umidade e 37,5 graus Celsius por aproximadamente 54 horas colocadas horizontalmente com as rotações de ovos desligadas. Desinfete a superfície do ovo com etanol a 70% sem girar o ovo. Em seguida, em um gabinete de fluxo laminar estéril enquanto estiver usando luvas, abra a casca do ovo usando uma pequena tesoura cirúrgica estéril e transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 6 poços.
Após cada ovo, desinfete a tesoura com etanol a 70%. Adicione aproximadamente 5 mililitros de água estéril às lacunas na placa de 6 poços, pois a umidade é essencial para evitar que o CAM seque. Em seguida, aspirar embriões com pontas inadequadas ou ovos não fertilizados com um aspirador a vácuo e, em seguida, coloque os embriões em uma incubadora até novos experimentos, mantendo uma temperatura de 37 graus Celsius em 80 a 90% de umidade.
Quando a CAM estiver suficientemente desenvolvida, geralmente a partir do dia embrionário 7, coloque um anel de silicone esterilizado na superfície da CAM ao longo dos pequenos capilares, evitando os principais vasos sanguíneos. Em condições estéreis, aplique um volume apropriado de solução de hipericina 30 microlitros no anel de silicone e mantenha os embriões em uma incubadora a 37 graus Celsius em 80 a 90% de umidade. Para realizar o diagnóstico fotodinâmico, ilumine a CAM usando luz de excitação violeta e registre a fluorescência de hipericina e tecido CAM e células tumorais com uma câmera digital em diferentes intervalos de tempo após a administração de hipericina.
Se a pesquisa exigir uma imagem da CAM em luz branca, registre a CAM antes da administração de hipericina e no final do experimento pouco antes da fixação tecidual, pois a luz desencadeia a fotoativação da hipericina. Para realizar a terapia fotodinâmica após a aplicação de hipericina, coloque o CAM sob a fibra óptica para que o feixe de laser cubra toda a área dentro do anel de silicone. Depois de realizar irradiação in vivo, neste caso particular com uma luz laser de 405 nanômetros a uma taxa de fluência de 285 miliwatts por centímetro quadrado, registre CAM usando luz branca e / ou luz fluorescente antes e após o tratamento fotodinâmico.
Fixe o tecido CAM em uma placa de cultivo com paraformaldeído a 4% em PBS por um mínimo de 2 horas e um máximo de durante a noite, em seguida, remova o paraformaldeído e corte cuidadosamente do CAM uma parte do tecido dentro do anel de silicone. Todas essas etapas devem ser feitas em um exaustor. Lave a parte cortada do tecido CAM em água por 10 minutos e posteriormente desidrate em série de álcool ascendente, colocando o tecido CAM em etanol a 70% por 3 minutos, solução de eosina por 2 minutos, trocina 96% etanol por 5 minutos, etanol a 100% por 5 minutos e duas vezes em xileno por 10 minutos em uma nova placa de Petri.
Subsequentemente, transferir as amostras o mais rapidamente possível para a parafina dissolvida em placas de Petri utilizando uma espátula ou escova fina. Após 24 horas, coloque o tecido em molde histológico, preencha-o com um meio de incorporação de parafina e deixe-o solidificar na geladeira, em seguida, corte o CAM solidificado do meio de incorporação, vire-o na bandeja em 90 graus, preencha-o novamente com o meio de incorporação e deixe-o solidificar. Prepare seções de 5 a 10 micrômetros em um micrótomo para análise histopatológica para determinar o dano induzido por TFD.
Para preparar as seções de CAM congeladas para histologia, monte cuidadosamente CAM fixo nativo ou 4% paraformaldeído na lâmina de vidro, encha o molde de incorporação até a metade com OCT e congele em nitrogênio líquido ou uma mistura de gelo seco e etanol. Após o congelamento, incline e deslize cuidadosamente o CAM da lâmina de vidro para a parte superior do meio OCT congelado. Coloque novamente no molde, cubra-o com o meio OCT e congele como descrito anteriormente.
Para a análise da vasculatura CAM, são necessárias amostras inteiras de CAM. No gabinete de fluxo laminar, transborde CAM com uma solução de fixação pré-aquecida de aldeído paraforme a 4% e glutaraldeído a 2% em PBS, retire a solução de fixação após 48 horas. Em seguida, separe cuidadosamente o CAM do embrião com micro tesoura e uma escova fina e lave-o em PBS, em seguida, monte o CAM lavado em uma lâmina de vidro e deixe-o secar lentamente.
Depois, fotografe o slide usando uma câmera digital em um transiluminador como fonte de luz branca homogênea. A localização do tumor na superfície CAM foi visualizada sob luz branca e luz fluorescente após a adição de hipericina. A análise histológica mostrou estruturas concêntricas de células escamosas anormais invadindo os tecidos sadios acompanhadas de edema e espessamento da membrana.
Após o tratamento com TFD, observou-se uma clara diferença na densidade do vaso dentro do anel e da área circundante. A radiação laser sem a presença de fotossensibilizador não causou nenhum dano comparável ao controle sem qualquer tratamento. Após 3 horas de incubação com hipericina, a irradiação a laser resultou em fluorescência causada pela monomerização da hipericina agregada com extenso dano à vasculatura.
A análise histológica revelou que a MAC controle não tratada apresentou espessura relativamente uniforme. No entanto, o tratamento com TFD fez com que a MAC se tornasse mais fina e frágil. Acabamos de demonstrar como preparar o ensaio de codorna ex ovo CAM e como usá-lo.
Embora mantendo as diretrizes, essa metodologia é fácil de dominar e pode provar resultados rápidos.
