تعتمد أهمية البروتوكول على الحد من الأخطاء البشرية وتلوث علم الأحياء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، مسؤولة عن إنتاج الآلاف من الكرويات لنهج الطباعة الحيوية 3D. الميزة الرئيسية لهذه المسألة ، على الرغم من ذلك ، هي أنها حسنت ساعات العمل.
تعتبر معلمات البرنامج حاسمة لأنها يمكن أن تؤثر على الجودة النهائية للكرويات. وأفضل نصيحة هي إجراء الاختبارات فقط باستخدام وسائط زراعة الخلايا. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنها طريقة تقليدية قديمة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد تعتمد على Begin عن طريق حصاد تعليق الخلايا الجذعية باستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر.
ثم ، جهاز طرد مركزي في 400 RCF لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه ASC. أعد تعليق حبيبات الخلايا باستخدام DMEM-Low الذي يحتوي على 10٪ FBS. بعد إجراء تعداد الخلايا ، خذ ASCs في أنابيب طرد مركزي منفصلة 15 ملليلتر لزرع 81 و 256 حالة ركود ميكرومصبوب بهيدروجيل غير ملتصق.
ارجع إلى مخطوطة النص للحصول على تفاصيل حول عدد الخلايا المستخدمة. أضف 500 ميكرولتر من محلول الأغاروز المعقم 2٪ فائق النقاء في وسط قالب سيليكون يحتوي على 81 أو 256 استراحة دائرية. بعد 40 دقيقة ، قم بفك قالب الأغاروز النقي للغاية من قالب السيليكون وضعه في بئر من لوحة بلاستيكية من 12 بئرا.
أضف ملليلترين من DMEM-Low في البئر مع الأغاروز المصبوب الدقيق واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع إمدادات ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي بنسبة 5٪ لمدة 12 ساعة على الأقل قبل بذر ASCs. تأكد من أن التدفق الرقائقي قيد التشغيل وأن تدفق الهواء في الخزانة يعمل بشكل صحيح. تأكد من توصيل الجهاز بالجهد الصحيح وأن الجهاز اللوحي متصل بالمعدات.
تحقق مما إذا كان ارتفاع زجاج حماية الخزانة في نفس مستوى وضع علامة المستشعر على المعدات. اضغط على زر التشغيل أو الإيقاف الموجود على الجانب الأيسر من الجهاز. ثم انتظر حتى يبدأ الجهاز اللوحي والمعدات.
ضع صناديق الأطراف ، ورف أنابيب الطرد المركزي ، واللوحة التي تحتوي على هيدروجيل الأغاروز المصبوب في مساحة عمل المعدات. في البرنامج المفتوح في الجهاز اللوحي، انقر فوق محرر LabWare. قم بإعداد طاولة عمل افتراضية واختر مواضع الماصات وصناديق الأطراف والحامل للأنابيب البلاستيكية والألواح.
انقر فوق الزر "التبديل إلى الإجراء" لتضمين جميع المعلمات والأوامر التي نفذتها المعدات طوال التجربة. انتظر حتى يتم فتح شريط أدوات وقائمة إجراءات في البرنامج. في البداية ، للإشارة إلى الأوامر ، قم بدمج عدد العينات التي سيتم ماصها واسحبها إلى قائمة الإجراءات.
ثم انقر فوق زر الأمر "نقل الكاشف" على البرنامج لنقل تعليق ASC إلى آبار لوحة 12 بئرا التي تحتوي على القوالب الدقيقة وسحبها إلى قائمة الإجراءات. انقر فوق خصائص"لإعداد مواضع البداية والنهاية" للمعدات لنقل العينة. انتظر حتى يعود البرنامج إلى صفحة جدول العمل.
قم بإعداد معلمات البذر الآلي ل ASCs كما هو موضح في مخطوطة النص. حدد الماء كنوع السائل القياسي. انقر فوق الزر "خيارات" لإعداد المعلمات لإنشاء تعليق متجانس ل ASCs كما هو موضح في مخطوطة النص.
انقر فوق الزر مع رمز التحقق "في الشريط العلوي من البرنامج لضمان عدم وجود خطأ في البرمجة. انقر فوق الزر "تشغيل" في الشريط العلوي من البرنامج لبدء تشغيل البرنامج. دع المعدات تبدأ كما هو مبرمج.
وانتظر حتى يصدر صوتا يشير إلى أنه قد انتهى. اجمع الصفيحة المكونة من 12 بئرا ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية مع إمدادات ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي بنسبة 5٪ لمدة 18 ساعة على الأقل ، للسماح بتكوين كرويات كاملة ومدمجة. حصاد الكرويات يدويا بعد يوم واحد وثلاثة وسبعة أيام من الثقافة للتحليل.
اغسل الوسط بماصة صغيرة لإطلاق الكرويات من هيدروجيل الأغاروز غير الملتصق بالقوالب الدقيقة. جمع الكروية يدويا باستخدام ماصة صغيرة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. تم قياس ما مجموعه 85 و 160 كروية من الهلاميات المائية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع 81 و 256 حالة ركود دائرية ، على التوالي.
قام نظام الماصة الأوتوماتيكي بزرع تعليق خلية ASC في 12 بئرا من صفيحة واحدة من 12 بئرا في 15 دقيقة. باستخدام 81 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، أنتجت 972 كروية في هذه الدراسة. في حين أن 256 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، أنتجت 3072 كروية.
تم تحليل الكرويات ASC للتأكد من تجانس حجمها وشكلها. أظهرت المنشطات ASC من القوالب الدقيقة مع 81 حالة ركود قطرا متجانسا خلال فترة الثقافة. على النقيض من المنشطات ASC من القوالب الدقيقة مع 256 حالة ركود ، كانت نسبة الأقطار الأصغر والأكبر قريبة من واحدة في الكرويات ASC من القوالب الدقيقة مع 81 و 256 حالة ركود.
وقدمت تحليلات الجدوى والتشكل والقوة دليلا على نجاح الإنتاج الواسع النطاق للكرويات ASC. الأكثر حالة هي التأكد من أن المشكلة قد تم حلها فجأة دون أخطاء.
