משמעות הפרוטוקול מסתמכת על צמצום טעויות אנוש וזיהום מיקרוביולוגי. בנוסף, אחראי לייצר אלפי ספרואידים לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית. היתרון העיקרי של העניין הזה, עם זאת, הוא שהוא מייעל את שעות העבודה.
הפרמטרים של התוכנה הם קריטיים מכיוון שהם יכולים להשפיע על האיכות הסופית של הספרואידים. והעצה הטובה ביותר תהיה לבצע בדיקות רק עם מדיה תרבית תאים. ההדגמה החזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שמדובר בשיטת תרבית תאים תלת-ממדית מסורתית ישנה המבוססת על בגין על ידי קצירת תרחיף תאי הגזע עם פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר והעברתה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.
לאחר מכן, צנטריפוגה ב 400 RCF במשך 5 דקות כדי לקבל את גלולת ASC. בצעו שימוש חוזר בכדור התא באמצעות DMEM-Low המכיל 10%FBS. לאחר ביצוע ספירת תאים, קח ASCs בצינורות צנטריפוגה נפרדים של 15 מיליליטר כדי לזרוע את 81 ו-256 המיתונים במיקרומולד עם הידרוג'ל שאינו דבק.
עיין בכתב היד של הטקסט לקבלת פרטים על מספר התאים שבהם נעשה שימוש. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת אגרוז סטרילית 2% טהורה במיוחד במרכז תבנית סיליקון המכילה 81 או 256 שקעים עגולים. לאחר 40 דקות, שחררו את האגרוז הטהור במיוחד מתבנית הסיליקון והניחו אותו בבאר של צלחת פלסטיק בת 12 בארות.
הוסיפו שני מיליליטרים של DMEM-Low בבאר עם האגרוז המיקרו-דחוס ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אספקת פחמן דו-חמצני אטמוספרית של 5% למשך 12 שעות לפחות לפני זריעת ה-ASCs. ודאו שהזרימה הלמינרית מופעלת וזרימת האוויר של הארון פועלת כראוי. ודא שהציוד מחובר למתח הנכון והטאבלט מחובר לציוד.
בדוק אם גובה זכוכית ההגנה על הארון הוא באותה רמה כמו סימון החיישן של הציוד. לחץ על לחצן ההפעלה או כיבוי בצד שמאל של הציוד. לאחר מכן, המתן עד שהטאבלט והציוד יתחילו.
מקם את תיבות הקצוות, את המדף לצינורות צנטריפוגה ואת הצלחת המכילה את הידרוג'ל האגרוז המיקרו-מסולסל בסביבת העבודה של הציוד. בתוכנה שנפתחה בטאבלט, לחץ על עורך LabWare. ערכו שולחן עבודה וירטואלי ובחרו את מיקומי הפיפטות, קופסאות הטיפים, המדף לצינורות הפלסטיק והצלחות.
לחץ על כפתור המעבר לפרוצדורה כדי לכלול את כל הפרמטרים והפקודות שבוצעו על ידי הציוד לאורך הניסוי. המתן עד לפתיחת סרגל כלים ורשימת פרוצדורות בתוכנה. בתחילה, כדי לציין את הפקודות, שלבו את מספר הדגימות שיש לצנרת וגררו אותו לרשימת הפרוצדורות.
לאחר מכן, לחץ על כפתור הפקודה של העברת המגיבים בתוכנה כדי להעביר את מתלי ה- ASC לבארות של לוחית 12 הקידוחים המכילה את תבניות המיקרו ולגרור אותה לרשימת הפרוצדורות. לחץ על מאפיינים "כדי להגדיר את מיקומי ההתחלה והסיום עבור הציוד להעברת הדגימה. המתן עד שהתוכנה תחזור לדף טבלת עבודה.
הגדר את הפרמטרים לזריעה אוטומטית של ה- ASCs כמתואר בכתב היד של הטקסט. בחר מים כסוג הנוזל הסטנדרטי. לחץ על כפתור האפשרויות כדי להגדיר את הפרמטרים כדי ליצור השעיה הומוגנית של ה- ASCs כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לחץ על הכפתור עם סימן סימון בסרגל העליון של התוכנה כדי לוודא שאין שגיאת תכנות. לחץ על כפתור ההפעלה בסרגל העליון של התוכנה כדי להפעיל את התוכנית. תן לציוד להתחיל כפי שתוכנת.
וחכו שהוא ישמיע צליל שיעיד על כך שהוא סיים. אספו את הצלחת בת 12 הבארות ואז דגרו אותה ב-37 מעלות צלזיוס עם אספקת פחמן דו-חמצני אטמוספרית של 5% למשך 18 שעות לפחות, כדי לאפשר היווצרות של כדוריות שלמות וקומפקטיות. לקטוף ידנית את הספרואידים לאחר יום, שלושה ושבעה ימים של תרבית לצורך ניתוח.
שטפו את המדיום במיקרו פיפטה כדי לשחרר את הספרואידים מההידרוג'ל האגרוז שאינו דבק במיקרומולד. אסוף את הספרואידים באופן ידני באמצעות מיקרו פיפטה והעביר אותם לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. בסך הכל נמדדו 85 ו-160 ספרואידים מהידרוג'לים שאינם דבקים במיקרומולד עם 81 ו-256 מיתונים מעגליים, בהתאמה.
מערכת הפיפטה האוטומטית זרעה את מתלי תאי ה-ASC ל-12 בארות של לוחית אחת בת 12 בארות תוך 15 דקות. באמצעות הידרוג'ל 81 מיקרומולד שאינו דבק, הפיק 972 ספרואידים במחקר זה. בעוד 256 מיקרומולד הידרוג'ל שאינו דבק, ייצר 3072 כדוריות.
כדורי ASC נותחו על ההומוגניות של גודלם וצורתם. סטרואידים ASC ממיקרו תבניות עם 81 מיתונים הראו קוטר הומוגני במהלך תקופת התרבית. בניגוד לסטרואידים ASC ממיקרו תבניות עם 256 מיתונים, יחס הקטרים הקטן והגדול ביותר היה קרוב לאחד בספרואידים ASC ממיקרו עובשים עם 81 ו-256 מיתונים.
הכדאיות, המורפולוגיה וניתוחי הכוח סיפקו ראיות לייצור מוצלח בקנה מידה גדול של כדורי ASC. המקרה הגדול ביותר של הוא להבטיח כי הבעיה נפתרה בפתאומיות ללא שגיאות.
