Protokolün önemi, insan hatalarını ve mikrobiyoloji kontaminasyonunu azaltmaya dayanmaktadır. Buna ek olarak, 3D biyobaskı yaklaşımları için binlerce sferoid üretmekten sorumludur. Bununla birlikte, bu konunun en büyük avantajı, çalışma saatlerini optimize etmesidir.
Yazılım parametreleri çok önemlidir çünkü sferoidlerin nihai kalitesini etkileyebilirler. Ve en iyi tavsiye, sadece hücre kültürü ortamı ile testler yapmak olacaktır. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü kök hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir serolojik pipetle hasat ederek ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktararak Begin'e dayanan eski bir geleneksel 3D hücre kültürü yöntemidir.
Daha sonra, ASC peletini elde etmek için 5 dakika boyunca 400 RCF'de santrifüj yapın. % 10 FBS içeren DMEM-Low kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre sayımını gerçekleştirdikten sonra, yapışmaz hidrojel ile mikro kalıplanmış 81 ve 256 durgunluklarını tohumlamak için ASC'leri ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüplerine alın.
Kullanılan hücre sayısının ayrıntıları için metin el yazmasına bakın. 81 veya 256 dairesel girinti içeren bir silikon kalıbın ortasına 500 mikrolitre steril% 2 ultra saf agaroz çözeltisi ekleyin. 40 dakika sonra, ultra saf agarozu silikon kalıptan çıkarın ve 12 delikli plastik plakanın bir kuyusuna yerleştirin.
Mikrokalıplanmış agaroz ile kuyuya iki mililitre DMEM-Low ekleyin ve ASC'leri tohumlamadan önce en az 12 saat boyunca% 5 atmosferik karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Laminer akışın açık olduğundan ve kabinin hava akışının düzgün çalıştığından emin olun. Ekipmanın doğru voltaja bağlı olduğunu ve tabletin ekipmana bağlı olduğunu onaylayın.
Kabin koruma camının yüksekliğinin, ekipmanın sensör işaretiyle aynı seviyede olup olmadığını kontrol edin. Ekipmanın sol tarafındaki açma veya kapama düğmesine basın. Ardından, tabletin ve ekipmanın başlamasını bekleyin.
Uç kutularını, santrifüj tüpleri için rafı ve mikrokalıplanmış agaroz hidrojelini içeren plakayı ekipmanın çalışma alanına yerleştirin. Tablette açılan yazılımda LabWare Editor'ı (LabWare Düzenleyicisi) tıklatın. Sanal bir çalışma masası kurun ve pipetlerin, uç kutularının, plastik tüplerin rafının ve plakaların konumlarını seçin.
Deney boyunca ekipman tarafından gerçekleştirilen tüm parametreleri ve komutları dahil etmek için "prosedüre geç" düğmesine tıklayın. Yazılımda bir araç çubuğunun ve prosedür listesinin açılmasını bekleyin. Başlangıçta, komutları belirtmek için, pipetlenecek örnek sayısını ekleyin ve yordam listesine sürükleyin.
Ardından, ASC süspansiyonunu mikro kalıpları içeren 12 delikli plakanın kuyularına aktarmak için yazılımdaki reaktif transferi" komut düğmesine tıklayın ve prosedür listesine sürükleyin. Ekipmanın numuneyi aktarması için "başlangıç" ve bitiş konumlarını ayarlamak üzere özellikler"e tıklayın. Yazılımın Çalışma Masası sayfasına dönmesini bekleyin.
ASC'lerin otomatik olarak tohumlanması için parametreleri metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın. Standart sıvı tip olarak suyu seçin. Metin makalesinde açıklandığı gibi ASC'lerin homojen bir süspansiyonunu oluşturmak üzere parametreleri ayarlamak için "seçenekler" düğmesine tıklayın.
Programlama hatası olmadığından emin olmak için yazılımın üst çubuğundaki "kontrol" sembolü bulunan düğmeye tıklayın. Programı başlatmak için yazılımın üst çubuğundaki oynat" düğmesine tıklayın. Ekipmanın programlandığı gibi başlamasına izin verin.
Ve bittiğini gösteren bir ses çıkarmasını bekleyin. 12 kuyucuklu plakayı toplayın, ardından tam ve kompakt sferoidlerin oluşumuna izin vermek için en az% 5'lik bir atmosferik karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Analiz için bir, üç ve yedi günlük kültürden sonra sferoidleri manuel olarak hasat edin.
Sferoidleri mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojelinden serbest bırakmak için ortamı bir mikro pipetle yıkayın. Bir mikro pipet kullanarak sferoidleri manuel olarak toplayın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Sırasıyla 81 ve 256 dairesel durgunluğa sahip mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojellerden toplam 85 ve 160 sferoid ölçülmüştür.
Otomatik pipet sistemi, ASC hücre süspansiyonunu 15 dakika içinde tek bir 12 delikli plakanın 12 kuyucuğuna yerleştirdi. 81 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojeli kullanarak, bu çalışmada 972 sferoid üretildi. 256 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojel iken, 3072 sferoid üretti.
ASC sferoidleri, boyutlarının ve şekillerinin homojenliği açısından analiz edildi. 81 resesyonlu mikro küflerden ASC steroidleri kültür döneminde homojen çap gösterdi. 256 durgunluğa sahip mikro kalıplardan ASC steroidlerinin aksine, en küçük ve en büyük çap oranı, 81 ve 256 durgunluklu mikro kalıplardan ASC sferoidlerinde bire yakındı.
Canlılık, morfoloji ve kuvvet analizleri, ASC sferoidlerinin başarılı, büyük ölçekli üretimi için kanıt sağlamıştır. En çok karşılaşılan durum, sorunun hatasız bir şekilde aniden çözülmesini sağlamaktır.
