La importancia del protocolo radica en la reducción de los errores humanos y la contaminación microbiológica. Además, responsable de producir miles de esferoides para enfoques de bioimpresión 3D. La principal ventaja de este asunto, sin embargo, es que ha optimizado las horas de trabajo.
Los parámetros del software son cruciales porque pueden influir en la calidad final de los esferoides. Y el mejor consejo sería realizar pruebas solo con medios de cultivo celular. La demostración visual de este método es crítica porque es un antiguo método tradicional de cultivo celular 3D basado en Begin recolectando la suspensión de células madre con una pipeta serológica de 10 mililitros y transfiriéndola a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Luego, centrífuga a 400 RCF durante 5 minutos para obtener el pellet ASC. Resuspend el pellet celular usando DMEM-Low que contiene 10% FBS. Después de realizar el recuento celular, tome ASC en tubos de centrífuga separados de 15 mililitros para sembrar las recesiones 81 y 256 micromoldeadas con hidrogel no adherente.
Consulte el manuscrito de texto para obtener detalles del número de celdas utilizadas. Agregue 500 microlitros de solución estéril de agarosa ultra pura al 2% en el centro de un molde de silicona que contenga 81 o 256 huecos circulares. Después de 40 minutos, desmoldar la agarosa ultra pura del molde de silicona y colocarla en un pozo de una placa de plástico de 12 pocillos.
Agregue dos mililitros de DMEM-Low en el pozo con la agarosa micromoldeada e incube a 37 grados Celsius con un suministro de dióxido de carbono atmosférico del 5% durante al menos 12 horas antes de sembrar los ASC. Asegúrese de que el flujo laminar esté encendido y que el flujo de aire del gabinete funcione correctamente. Confirme que el equipo está conectado al voltaje correcto y que la tableta está conectada al equipo.
Compruebe si la altura del vidrio de protección del gabinete está al mismo nivel que el marcado del sensor del equipo. Presione el botón de encendido o apagado en el lado izquierdo del equipo. Luego, espere a que comiencen la tableta y el equipo.
Coloque las cajas de punta, el bastidor para tubos de centrífuga y la placa que contiene el hidrogel de agarosa micromoldeado en el espacio de trabajo del equipo. En el software abierto en la tableta, haga clic en LabWare Editor. Configure una mesa de trabajo virtual y elija las posiciones de las pipetas, las cajas de punta, el bastidor para los tubos de plástico y las placas.
Haga clic en el botón "Cambiar a procedimiento" para incluir todos los parámetros y comandos llevados a cabo por el equipo a lo largo del experimento. Espere a que se abra una barra de herramientas y una lista de procedimientos en el software. Inicialmente, para indicar los comandos, incorpore el número de muestras que se van a pipetear y arrástrelo a la lista de procedimientos.
Luego, haga clic en el botón de comando "transferencia de reactivos" en el software para transferir la suspensión ASC a los pocillos de la placa de 12 pocillos que contiene los micro moldes y arrástrela a la lista de procedimientos. Haga clic en propiedades"para configurar las posiciones de inicio y fin para que el equipo transfiera la muestra. Espere a que el software vuelva a la página Tabla de trabajo.
Configure los parámetros para la siembra automatizada de los ASC como se describe en el manuscrito de texto. Seleccione el agua como el tipo de líquido estándar. Haga clic en el botón "opciones" para configurar los parámetros para crear una suspensión homogénea de los ASC como se describe en el manuscrito de texto.
Haga clic en el botón con un símbolo de verificación en la barra superior del software para asegurarse de que no haya ningún error de programación. Haga clic en el botón reproducir en la barra superior del software para iniciar el programa. Deje que el equipo comience según lo programado.
Y espera a que emita un sonido que indique que ha terminado. Recoja la placa de 12 pocillos y luego incube a 37 grados Celsius con un suministro de dióxido de carbono atmosférico del 5% durante al menos 18 horas, para permitir la formación completa y compacta de esferoides. Cosechar manualmente los esferoides después de uno, tres y siete días de cultivo para su análisis.
Enjuague el medio con una micro pipeta para liberar los esferoides del hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado. Recoge los esferoides manualmente con una micro pipeta y transfiérelos a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Se midieron un total de 85 y 160 esferoides a partir de hidrogeles no adhesivos micromoldeados con 81 y 256 recesiones circulares, respectivamente.
El sistema automático de pipetas sembró la suspensión de celdas ASC en 12 pocillos de una sola placa de 12 pocillos en 15 minutos. Utilizando el hidrogel no adherente micromoldeado 81, se produjeron 972 esferoides en este estudio. Mientras que el hidrogel no adherente micromoldeado 256 produjo 3072 esferoides.
Los esferoides ASC fueron analizados por la homogeneidad de su tamaño y forma. Los esteroides ASC de micromoles con 81 recesiones mostraron un diámetro homogéneo durante el período de cultivo. En contraste con los esteroides ASC de micro moldes con 256 recesiones, la relación de diámetros más pequeño y más grande fue cercana a uno en los esferoides ASC de micro moldes con 81 y 256 recesiones.
Los análisis de viabilidad, morfología y fuerza proporcionaron evidencia para la producción exitosa y a gran escala de esferoides ASC. El mayor caso es asegurarse de que el problema se resolvió abruptamente sin errores.
