على الرغم من أن عددا لا يحصى من الميكروبات يستعمر جذور النباتات ، إلا أنه من الصعب تحليل هذه التفاعلات لأنها تحدث تحت الأرض. ولتسهيل ذلك، توفر مجموعة البروتوكولات هذه لمحة عامة عن استراتيجيات تلقيح جذور النباتات بالميكروبات التي تنقلها التربة. التلقيح الجذري هو الأساس لدراسة تفاعلات ميكروبات الجذر ، وباستخدام التقنيات التالية ، يمكن دراسة التفاعلات على المستوى الجزيئي أو الخلوي أو النسيجي.
نوضح ثلاثة أنظمة تلقيح باستخدام الفيرتيسيليوم كميكروب غازي للجذر ، والنبات النموذجي ، أرابيدوبسيس. ومع ذلك ، فإن نقل الطرق إلى نباتات أخرى مثل الطماطم أو اغتصاب البذور الزيتية ، وإلى ميكروبات الجذر الأخرى ، على سبيل المثال الصدفة المفيدة ، أمر ممكن. تحضير لقاح الفيرتيسيليوم مقدما عن طريق زراعة الميسيليا في PDB وتحفيز الجراثيم ومرق سكر العنب Czapek.
ثم ابدأ بصب الوسط المعقم في أطباق بتري. بعد تصلب الوسط ، أعد تعبئة أطباق بتري في كيس بلاستيكي معقم وتخزينها رأسا على عقب طوال الليل في الثلاجة عند أربع إلى 10 درجات مئوية. قطع وإزالة قناة العدوى في الثلث العلوي من الوسط الصلب باستخدام مشرط.
تجنب الحصول على السائل أو الهواء تحت وسط الأجار أثناء القطع. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة معقم لتوزيع 50 إلى 100 من بذور أرابيدوبسيس المعقمة السطحية على السطح العلوي المقطوع. ضع البذور في الزاوية التي يلامس فيها سطح الأجار المقطوع جدار طبق بتري بحيث يمكن أن تنمو الجذور بينهما.
أغلق أطباق بتري وأغلقها بشريط لاصق قابل للتنفس للسماح بتبادل الغازات. احتفظ بأطباق بتري في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة يومين للتقسيم الطبقي لضمان إنبات متزامن وفعال. ثم ضع الألواح عموديا في رف وتنمو النباتات في غرفة نمو في ظل ظروف اليوم الطويل.
بعد تسعة إلى 11 يوما عندما تصل الجذور إلى قناة العدوى ، ضع الألواح أفقيا وافتحها. ثم أضف 500 ميكرولتر من Verticillium conidia التي تم حصادها حديثا مباشرة في قناة العدوى. قم بإعداد لوحات التحكم عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول وهمي بدلا من الجراثيم.
احتضان كل من لوحات التحكم وبوغ التلقيح أفقيا حتى ينقع السائل في. ثم أغلق الغطاء وأغلق الألواح بشريط لاصق قابل للتنفس. قم بتغطية أجزاء الجذر بصناديق ورقية سوداء لتغميق الجذور والفطريات التي تنقلها التربة.
احتضان الألواح عموديا في غرفة النمو. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح. أولا ، قم بتعقيم أكواب بلاستيكية شفافة سعة 500 ملليلتر في حمام إيثانول بنسبة 70 إلى 75٪ لمدة 20 دقيقة.
جفف الكؤوس في غطاء تدفق الصفيحة. صب الوسط المعقم في الأكواب البلاستيكية. قم بإعداد طبقة بلاستيكية مع خمسة ثقوب مسبقة الصنع واحدة كبيرة في الوسط وأربعة أصغر في كل زاوية.
ضع الطبقة البلاستيكية على الوسط قبل أن تتصلب. قطع الأجار بمشرط من خلال فتحة المركز الجاهزة إلى عمق حوالي 1.5 سم. قم بإزالة الآجار المقطوع لإنشاء قناة عدوى لإضافة الجراثيم الفطرية لاحقا.
خدش وسط الأجار قليلا بطرف ماصة في الثقوب الأربعة الأصغر لمقاطعة الجلد الصلب. ضع البذور باستخدام طرف ماصة في الثقوب الأصغر. أغلق الكوب البلاستيكي بكوب بلاستيكي مقلوب ثان وختم بشريط لاصق قابل للتنفس.
حافظ على النباتات عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام في الظلام للتقسيم الطبقي. ثم احتضان أنظمة الكأس في غرفة النمو. لتلقيح النباتات ب verticillium ، أضف ملليلتر واحد من محلول conidia إلى قناة العدوى.
للحصول على عناصر التحكم، أضف ملليلتر واحد من وسط MS الخالي من الجراثيم كحل وهمي. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح. أولا ، امزج التربة والرمل جيدا بنسبة حجمية ثلاثة إلى واحد مما يسهل غسل الركيزة من الجذور لاحقا.
يسكب الخليط في كيس الأوتوكلاف ويطهى على البخار على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الأوتوكلاف. املأ الأواني بخليط التربة والرمل وانقلها إلى صواني. أضف الماء إلى الصواني حوالي ثلث ارتفاع الوعاء للنقع الموحد لخليط التربة والرمال.
رش الماء على الخليط لضمان ظروف البدء الرطبة. زرع ثلاث إلى أربع بذور في كل وعاء على مسافة كافية من بعضها البعض. احتفظ بها للتقسيم الطبقي عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام في الظلام.
اسمح للشتلات بالنمو في ظل ظروف اليوم الطويل مع الري المنتظم ، ثم اختر النباتات ذات الحجم والعمر المماثلين لإجراء تلقيح غمس الجذر. أخرج التربة من الأواني وحفر الجذور. اغسل الجذور بلطف في وعاء ماء وحافظ على الورود خارج الماء.
احتضن الجذور لمدة 60 دقيقة في طبق بتري يحتوي على محلول بوغ الفيرتيسيليوم أو محلول وهمي. إعداد الأواني الجديدة مع التربة الرطبة المعقمة بالبخار دون الرمل. استخدم طرف ماصة لعمل ثقب في وسط التربة في كل وعاء.
ضع الجذور مباشرة في الحفرة وأعد ملء الثقوب بلطف بالتربة لتجنب الضغط الإضافي على النباتات. زراعة النباتات تحت ظروف يوم طويل مع سقي منتظم. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح.
في النظام القائم على طبق بتري ، تم تصور العدوى الناجحة للفيرتيسيليوم في جذور أرابيدوبسيس. بعد يومين من التلقيح ، تم تحفيز جين العلامة MYB51 بقوة في الجذور المصابة مقارنة بالتحكم ، وهو ما أكده تحليل QRTPCR. في النظام القائم على الكوب ، تم العثور على كمية عالية من الحمض النووي الفطري في أوراق النباتات المصابة كما يوضح الرسم البياني مقارنة بالتحكم الوهمي بعد 12 يوما من التلقيح.
أظهر تحليل QRTPCR وفرة نسخ غنية من جين العلامة MYB51 في جذور أرابيدوبسيس. باستخدام هذا النظام ، تم تلقيح الفيرتيسيليوم إلى أنواع نباتية نموذجية أخرى. في اغتصاب البذور الزيتية ، كان من الممكن اكتشاف الحمض النووي الفطري في شرائح الساق المقطوعة في قاعدة الشتلات بعد 12 يوما من التلقيح في الجذور.
كما تم الكشف عن الحمض النووي الفطري في سيقان الطماطم مما يشير إلى انتشار العامل الممرض داخل النبات. بعد 21 يوما من التلقيح باستخدام النظام القائم على التربة ، بدت وريدات نباتات أرابيدوبسيس المعالجة الوهمية صحية وخضراء بينما أظهرت النباتات المصابة أوراقا صفراء أو نخرية وكان لها مساحة أوراق خضراء أقل بالنسبة للمحاكاة الوهمية التي تشير إلى الإصابة الناجحة. انتبه عند قطع قناة العدوى في نظام طبق بتري لمنع الأجار من الانزلاق.
بتطبيق النظام القائم على التربة ، لا تضغط التربة حول الجذور أثناء إعادة الصب لتجنب المزيد من الضغط على النباتات. بعد تلقيح الجذر ، على سبيل المثال ، يمكن إجراء اختبارات ممرضة ، أو تحليل التعبير الجيني ، أو علم الجينوم الوظيفي أو اختبارات الكيماويات الزراعية ، مما يوفر رؤى جديدة حول تفاعلات ميكروبات الجذر وأدوات لتحسين الزراعة.
