Sayısız mikrop bitki köklerini kolonileştirse de, bu etkileşimlerin yeraltında gerçekleştikleri için analiz edilmesi zordur. Bunu kolaylaştırmak için, bu protokol koleksiyonu, bitki köklerini toprak kaynaklı mikroplarla aşılama stratejilerine genel bir bakış sunmaktadır. Kök aşılaması, kök mikrop etkileşimlerini incelemek için temeldir ve aşağıdaki teknikler kullanılarak, etkileşimler moleküler, sitolojik veya histolojik düzeyde incelenebilir.
Verticillium'u kök istilacı mikrop olarak kullanan üç aşılama sistemini ve örnek bitki olan arabidopsis'i açıklıyoruz. Bununla birlikte, yöntemlerin domates veya yağlı tohumlu kolza gibi diğer bitkilere ve diğer kök mikroplarına, örneğin faydalı serendipita'ya aktarılması mümkündür. Verticillium inoculum'u PDB'de miseliyi kültürleyerek ve sporülasyonu ve Czapek dekstroz suyunu indükleyerek önceden hazırlayın.
Daha sonra otoklavlanmış ortamı Petri kaplarına dökerek başlayın. Ortamın sertleşmesinden sonra, Petri bulaşıklarını steril bir plastik torbada yeniden paketleyin ve buzdolabında gece boyunca dört ila 10 santigrat derecede baş aşağı saklayın. Katılaşmış ortamın üst üçte birindeki bir enfeksiyon kanalını bir neşterle kesin ve çıkarın.
Kesim sırasında agar ortamının altına sıvı veya hava girmekten kaçının. Daha sonra, kesilen üst yüzeye 50 ila 100 yüzey sterilize edilmiş arabidopsis tohumu dağıtmak için steril bir pipet ucu kullanın. Tohumları, kesilmiş agar yüzeyinin Petri çanağı duvarına temas ettiği açıya koyun, böylece kökler aralarında büyüyebilir.
Petri bulaşıklarını kapatın ve gaz değişimine izin vermek için nefes alabilen bir yapışkan bantla kapatın. Petri kaplarını, senkronize ve verimli çimlenmeyi sağlamak için tabakalaşma için iki gün boyunca karanlıkta dört santigrat derecede tutun. Daha sonra plakaları dikey olarak bir rafa yerleştirin ve bitkileri uzun gün koşullarında bir büyüme odasında büyütün.
Kökler enfeksiyon kanalına ulaştığında dokuz ila 11 gün sonra, plakaları yatay olarak yerleştirin ve açın. Daha sonra 500 mikrolitre taze hasat edilmiş Verticillium conidia'yı doğrudan enfeksiyon kanalına ekleyin. Sporlar yerine 500 mikrolitre sahte çözelti ekleyerek kontrol plakaları hazırlayın.
Hem kontrol hem de spor aşılanmış plakaları, sıvı ıslanana kadar yatay olarak inkübe edin. Ardından kapağı kapatın ve plakaları nefes alabilen yapışkan bantla kapatın. Kökleri ve toprak kaynaklı mantarları koyulaştırmak için kök kısımlarını siyah kağıt kutularla örtün.
Plakaları büyüme odasında dikey olarak inkübe edin. Aşılama sonrası analizleri tercih edilen zaman noktalarında gerçekleştirin. İlk olarak, şeffaf 500 mililitrelik plastik bardakları 20 dakika boyunca% 70 ila% 75 etanol banyosuna sterilize edin.
Bardakları lamina akış davlumbazında kurulayın. Otoklavlanmış ortamı plastik bardaklara dökün. Merkezde bir büyük ve her köşede dört küçük olmak üzere beş adet önceden imal edilmiş deliğe sahip plastik bir tabaka hazırlayın.
Plastik tabakayı katılaşmadan önce ortama yerleştirin. Agar'ı önceden imal edilmiş orta delikten yaklaşık 1,5 santimetre derinliğe kadar bir neşterle kesin. Daha sonra mantar sporlarını eklemek üzere bir enfeksiyon kanalı oluşturmak için kesilmiş agar'ı çıkarın.
Katılaşmış cildi kesmek için agar ortamını dört küçük delikteki pipet ucuyla hafifçe çizin. Tohumları bir pipet ucu kullanarak daha küçük deliklere yerleştirin. Plastik bardağı ikinci bir ters çevrilmiş plastik fincanla kapatın ve nefes alabilen yapışkan bantla kapatın.
Bitkileri tabakalaşma için karanlıkta üç gün boyunca dört santigrat derecede tutun. Daha sonra fincan sistemlerini büyüme odasında inkübe edin. Plantletleri verticillium ile aşılamak için, enfeksiyon kanalına bir mililitre konidia çözeltisi ekleyin.
Kontroller için, sahte bir çözüm olarak bir mililitre mikropsuz dörtte bir MS ortamı ekleyin. Aşılama sonrası analizleri tercih edilen zaman noktalarında gerçekleştirin. İlk olarak, toprağı ve kumu üç ila bir hacimsel oranda iyice karıştırın, bu da substratın daha sonra köklerden yıkanmasını kolaylaştırır.
Karışımı bir otoklav torbasına dökün ve bir otoklavda 20 dakika boyunca 80 santigrat derecede buharlayın. Saksıları toprak-kum karışımıyla doldurun ve tepsilere aktarın. Toprak-kum karışımının düzgün bir şekilde ıslatılması için tepsilere bir tencerenin yüksekliğinin yaklaşık üçte biri kadar su ekleyin.
Islak başlangıç koşullarını sağlamak için karışıma su püskürtün. Her tencereye birbirinden yeterince uzakta üç ila dört tohum ekin. Onları karanlıkta üç gün boyunca dört santigrat derecede tabakalaşma için saklayın.
Fidelerin düzenli sulama ile uzun gün koşullarında büyümesine izin verin, ardından kök daldırma aşılamasını gerçekleştirmek için benzer büyüklükte ve yaşta bitkiler toplayın. Toprağı saksılardan çıkarın ve kökleri kazın. Kökleri bir su kabında nazikçe yıkayın ve rozetleri sudan uzak tutun.
Kökleri, verticillium spor çözeltisi veya sahte çözelti içeren bir Petri kabında 60 dakika boyunca inkübe edin. Kumsuz nemli buharla sterilize edilmiş toprakla yeni saksılar hazırlayın. Her tencerede toprağın ortasında bir delik açmak için bir pipet ucu kullanın.
Kökleri doğrudan deliğe yerleştirin ve bitkilere ek stresi önlemek için delikleri yavaşça toprakla doldurun. Bitkileri düzenli sulama ile uzun gün koşullarında yetiştirin. Aşılama sonrası analizleri tercih edilen zaman noktalarında gerçekleştirin.
Petri kabı bazlı sistemde, arabidopsisin köklerinde başarılı verticillium enfeksiyonu görselleştirildi. Aşılamadan iki gün sonra, belirteç geni MYB51, QRTPCR analizi ile doğrulanan kontrole kıyasla enfekte köklerde güçlü bir şekilde indüklendi. Bardak bazlı sistemde, enfekte olmuş bitkilerin yapraklarında, grafiğin gösterdiği gibi, 12 günlük aşılamadan sonra sahte kontrole kıyasla yüksek miktarda mantar DNA'sı bulunmuştur.
QRTPCR analizi, arabidopsis köklerinde MYB51 belirteç geninin zenginleştirilmiş transkript bolluğunu gösterdi. Bu sistem kullanılarak, verticillium diğer model bitki türlerine aşılandı. Yağlı tohum kolzasında, mantar DNA'sı, köklerde aşılamadan 12 gün sonra fidelerin tabanında kesilen kök segmentlerinde tespit edilebilirdi.
Mantar DNA'sı, patojenin bitki içindeki yayılımını gösteren domates saplarında da tespit edildi. Toprak bazlı sistemi kullanarak aşılamadan 21 gün sonra, sahte işlenmiş arabidopsis bitkilerinin rozetleri sağlıklı ve yeşil görünürken, enfekte olmuş bitkiler sarımsı veya nekrotik yapraklar gösterdi ve başarılı enfeksiyonu gösteren alaycılığa göre daha az yeşil yaprak alanına sahipti. Agarın kaymasını önlemek için Petri kabı sistemindeki enfeksiyon kanalını keserken dikkat edin.
Toprak bazlı sistemi uygulayarak, bitkilere daha fazla stres vermemek için saksılama yaparken toprağı köklerin etrafına sıkıştırmayın. Kök aşılamasından sonra, örneğin, patojenik testler, gen ekspresyonunun analizi, fonksiyonel genomik veya zirai kimyasal testler, kök mikrop etkileşimleri ve tarımı geliştirmek için araçlar hakkında yeni bilgiler sağlayarak gerçekleştirilebilir.
