Sebbene innumerevoli microbi colonizzino le radici delle piante, queste interazioni sono difficili da analizzare poiché avvengono sottoterra. Per facilitare questo, questa raccolta di protocolli fornisce una panoramica delle strategie per inoculare le radici delle piante con microbi trasmessi dal suolo. L'inoculazione radicale è la base per lo studio delle interazioni dei microbi radicali e, utilizzando le seguenti tecniche, le interazioni possono essere studiate a livello molecolare, citologico o istologico.
Spieghiamo tre sistemi di inoculazione che utilizzano verticillium come microbo invasore delle radici e la pianta modello, arabidopsis. Tuttavia, è possibile il trasferimento dei metodi ad altre piante come il pomodoro o la colza e ad altri microbi radicali, ad esempio la serendipita benefica. Preparare il verticillium inoculum in anticipo coltivando i miceli in PDB e inducendo sporulazione e brodo di destrosio Czapek.
Quindi iniziare versando il mezzo autoclavato in piastre di Petri. Dopo l'indurimento del mezzo, reimballare le piastre di Petri in un sacchetto di plastica sterile e conservarle a testa in giù durante la notte in frigorifero a quattro-10 gradi Celsius. Tagliare e rimuovere un canale di infezione nel terzo superiore del mezzo solidificato con un bisturi.
Evitare di ottenere liquido o aria sotto il mezzo agar durante il taglio. Quindi, utilizzare una punta di pipetta sterile per distribuire da 50 a 100 semi di arabidopsis sterilizzati in superficie sulla superficie superiore tagliata. Metti i semi nell'angolo in cui la superficie dell'agar tagliata entra in contatto con la parete della capsula di Petri in modo che le radici possano crescere tra di loro.
Chiudere le piastre di Petri e sigillarle con un nastro adesivo traspirante per consentire lo scambio di gas. Mantenere le piastre di Petri al buio a quattro gradi Celsius per due giorni per la stratificazione per garantire una germinazione sincronizzata ed efficiente. Quindi posizionare le piastre verticalmente in un rack e far crescere le piante in una camera di crescita in condizioni di lunga giornata.
Dopo nove o 11 giorni quando le radici raggiungono il canale di infezione, posare le piastre orizzontalmente e aprirle. Quindi aggiungere 500 microlitri di Verticillium conidia appena raccolti direttamente nel canale di infezione. Preparare le piastre di controllo aggiungendo 500 microlitri di una soluzione fittizia invece delle spore.
Incubare sia le piastre di controllo che quelle inoculate con spore orizzontalmente fino a quando il liquido non si è immerso. Quindi chiudere il coperchio e sigillare le piastre con nastro adesivo traspirante. Coprire le parti della radice con scatole di carta nera per scurire le radici e i funghi trasportati dal suolo.
Incubare le piastre verticalmente nella camera di crescita. Eseguire le analisi nei punti temporali preferiti dopo l'inoculazione. In primo luogo, sterilizzare bicchieri di plastica trasparenti da 500 millilitri in un bagno di etanolo dal 70 al 75% per 20 minuti.
Asciugare le tazze nella cappa a flusso lamina. Versare il mezzo autoclavato nei bicchieri di plastica. Preparare uno strato di plastica con cinque fori prefabbricati uno grande al centro e quattro più piccoli in ogni angolo.
Posizionare lo strato di plastica sul supporto prima che si solidifichi. Tagliare l'agar con un bisturi attraverso il foro centrale prefabbricato ad una profondità di circa 1,5 centimetri. Rimuovere l'agar tagliato per creare un canale di infezione per aggiungere le spore fungine in seguito.
Grattare leggermente l'agar medio con una punta di pipetta nei quattro fori più piccoli per interrompere la pelle solidificata. Posizionare i semi usando una punta di pipetta nei fori più piccoli. Chiudere il bicchiere di plastica con un secondo bicchiere di plastica invertito e sigillare con nastro adesivo traspirante.
Mantenere le piante a quattro gradi Celsius per tre giorni al buio per la stratificazione. Quindi incubare i sistemi di tazze nella camera di crescita. Per inoculare le piantine con verticillium, aggiungere un millilitro di soluzione di conidi nel canale di infezione.
Per i controlli, aggiungere un millilitro di germ free un quarto di MS medium come soluzione fittizia. Eseguire le analisi nei punti temporali preferiti dopo l'inoculazione. In primo luogo, mescolare accuratamente il terreno e la sabbia in un rapporto volumetrico di tre a uno che facilita il lavaggio del substrato dalle radici in seguito.
Versare il composto in un sacchetto di autoclave e cuocere a vapore a 80 gradi Celsius per 20 minuti in autoclave. Riempire i vasi con la miscela di terra e sabbia e trasferirli in vassoi. Aggiungere acqua nei vassoi a circa un terzo dell'altezza di una pentola per un ammollo uniforme della miscela terra-sabbia.
Spruzzare acqua la miscela per garantire condizioni di partenza bagnate. Semina da tre a quattro semi in ogni vaso a una distanza sufficiente l'uno dall'altro. Tenerli per la stratificazione a quattro gradi Celsius per tre giorni al buio.
Lasciare che le piantine crescano in condizioni di lunga giornata con annaffiature regolari, quindi raccogliere piante di dimensioni ed età simili per eseguire l'inoculazione della radice. Prendi il terreno dai vasi e scava le radici. Lavare delicatamente le radici in un contenitore d'acqua e tenere le rosette fuori dall'acqua.
Incubare le radici per 60 minuti in una capsula di Petri contenente la soluzione di spore verticillium o la soluzione finta. Preparare nuovi vasi con terreno sterilizzato a vapore umido senza sabbia. Usa una punta della pipetta per fare un buco al centro del terreno in ogni pentola.
Posizionare le radici direttamente nel foro e riempire delicatamente i fori con il terreno per evitare ulteriori stress alle piante. Coltivare le piante in condizioni di lunga giornata con annaffiature regolari. Eseguire le analisi nei punti temporali preferiti dopo l'inoculazione.
Nel sistema basato sulla capsula di Petri, l'infezione riuscita di verticillium è stata visualizzata nelle radici di arabidopsis. Due giorni dopo l'inoculazione, il gene marcatore MYB51 è stato fortemente indotto nelle radici infette rispetto al controllo, il che è stato confermato dall'analisi QRTPCR. Nel sistema a coppa, un'elevata quantità di DNA fungino è stata trovata nelle foglie delle piante infette, come mostra il grafico rispetto al controllo simulato dopo 12 giorni di inoculazione.
L'analisi QRTPCR ha mostrato un'abbondanza di trascrizione arricchita del gene marcatore MYB51 nelle radici di arabidopsis. Usando questo sistema, verticillium è stato inoculato ad altre specie di piante modello. Nella colza, il DNA fungino era rilevabile nei segmenti dello stelo tagliati alla base delle piantine 12 giorni dopo l'inoculazione alle radici.
Il DNA fungino è stato rilevato anche negli steli di pomodoro che indicano la propagazione dell'agente patogeno all'interno della pianta. 21 giorni dopo l'inoculazione utilizzando il sistema a base di suolo, le rosette delle finte piante di arabidopsis trattate sembravano sane e verdi mentre le piante infette mostravano foglie giallastre o necrotiche e avevano un'area fogliare verde minore rispetto alla finta indicazione di infezione riuscita. Prestare attenzione quando si taglia il canale di infezione nel sistema della capsula di Petri per evitare che l'agar scivoli.
Applicando il sistema a base di suolo, non comprimere il terreno intorno alle radici durante il rinvaso per evitare ulteriori stress alle piante. Dopo l'inoculazione radicale, ad esempio, possono essere eseguiti test patogeni, analisi dell'espressione genica, genomica funzionale o test agrochimici fornendo nuove informazioni sulle interazioni dei microbi radicali e sugli strumenti per migliorare l'agricoltura.
