אף על פי שאינספור מיקרובים מתיישבים עם שורשי צמחים, קשה לנתח את האינטראקציות האלה כשהן מתרחשות מתחת לאדמה. כדי להקל על כך, אוסף פרוטוקולים זה מספק סקירה כללית של אסטרטגיות לחיסון שורשי צמחים באמצעות מיקרובים הנישאים באדמה. חיסון שורשים הוא הבסיס לחקר אינטראקציות בין חיידקים שורשיים, ובאמצעות הטכניקות הבאות ניתן לחקור אינטראקציות ברמה מולקולרית, ציטולוגית או היסטולוגית.
אנו מסבירים שלוש מערכות חיסון המשתמשות בקודקודים כמיקרובים פולשים לשורשים, ובצמח המודל, אראבידופסיס. עם זאת, העברת השיטות לצמחים אחרים כגון אונס עגבניות או זרעי שמן, ולמיקרובי שורשים אחרים, למשל סרנדיפיטה מועילה, אפשרית. הכן את אינוקולום הקודקוד מראש על ידי גידול המיציליה ב- PDB וגרימת sporulation ומרק דקסטרוז Czapek.
ואז להתחיל על ידי מזיגת המדיום autoclaved לתוך כלי פטרי. לאחר התקשות המדיום, ארזו מחדש את כלי הפטרי בשקית ניילון סטרילית ואחסנו אותם הפוך למשך הלילה במקרר בטמפרטורה של 4 עד 10 מעלות צלזיוס. חותכים ומסירים תעלת זיהום בשליש העליון של המדיום הממוצק עם אזמל.
הימנעו מלהיכנס לנוזל או לאוויר מתחת למדיום האגר בזמן החיתוך. לאחר מכן, השתמשו בקצה פיפטה סטרילי כדי להפיץ 50 עד 100 זרעי ערבידופסיס מעוקרים על פני השטח על המשטח העליון החתוך. שימו את הזרעים בזווית שבה משטח האגר החתוך נוגע בדופן צלחת פטרי כדי שהשורשים יוכלו לצמוח ביניהם.
סגרו את כלי הפטרי ואטמו אותם בנייר דבק נושם כדי לאפשר חילופי גזים. שמור את צלחות הפטרי בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים לריבוד כדי להבטיח נביטה מסונכרנת ויעילה. לאחר מכן מניחים את הצלחות בצורה אנכית במדף ומגדלים את הצמחים בתא גידול בתנאי יום ארוכים.
לאחר תשעה עד 11 ימים כאשר השורשים מגיעים לתעלת ההדבקה, הניחו את הלוחות אופקית ופתחו אותן. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של Verticillium conidia שזה עתה נקטפו ישירות לתעלת ההדבקה. הכינו לוחות בקרה על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של תמיסה מדומה במקום נבגים.
דגירה הן של צלחות בקרה והן של נבגים מחוסנים אופקית עד שהנוזל נספג פנימה. לאחר מכן סגרו את המכסה ואטמו את הצלחות עם סרט דבק נושם. כסו את חלקי השורשים בקופסאות נייר שחורות כדי להכהות שורשים ופטריות הנישאות באדמה.
דגירה אנכית של הלוחות בתא הגידול. בצע את הניתוחים בנקודות הזמן המועדפות לאחר החיסון. ראשית, לעקר כוסות פלסטיק שקופות של 500 מיליליטר לתוך 70 עד 75% אמבט אתנול למשך 20 דקות.
מייבשים את הכוסות במכסה המנוע של זרימת הלמינה. יוצקים את המדיום האוטוקלבי לכוסות הפלסטיק. הכינו שכבת פלסטיק עם חמישה חורים מפוברקים מראש אחד גדול במרכז וארבעה קטנים יותר בכל פינה.
מניחים את שכבת הפלסטיק על המדיום לפני שהיא מתמצקת. חותכים את האגר עם אזמל דרך החור המרכזי המפוברק מראש לעומק של כ-1.5 סנטימטרים. הסר את האגר החתוך כדי ליצור תעלת זיהום כדי להוסיף את הנבגים הפטרייתיים מאוחר יותר.
מגרדים מעט את מדיום האגר עם קצה פיפטה בארבעת החורים הקטנים יותר כדי להפריע לעור המוצק. מניחים את הזרעים בעזרת קצה פיפטה לתוך החורים הקטנים יותר. סוגרים את הפלסטיק בכוס פלסטיק הפוכה שנייה ואוטמים עם סרט דבק נושם.
שמור את הצמחים בארבע מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים בחושך לריבוד. לאחר מכן דגירה של מערכות הכוס בתא הגידול. כדי לחסן צמחים עם קודקודים, מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת קונידיה לערוץ ההדבקה.
עבור פקדים, הוסף מיליליטר אחד של נבט ללא חיידקים רבע טרשת נפוצה בינונית כפתרון מדומה. בצע את הניתוחים בנקודות הזמן המועדפות לאחר החיסון. ראשית, ערבבו היטב אדמה וחול ביחס נפחי של שלושה לאחד, מה שמקל על שטיפת המצע מהשורשים מאוחר יותר.
יוצקים את התערובת לתוך שקית אוטוקלאב ומאדים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באוטוקלב. ממלאים את העציצים בתערובת חול האדמה ומעבירים אותם למגשים. מוסיפים מים למגשים כשליש מגובה הסיר להשריה אחידה של תערובת חול האדמה.
מים מרססים את התערובת כדי להבטיח תנאי התחלה רטובים. זרעו שלושה עד ארבעה זרעים בכל סיר במרחק מספיק זה מזה. שמור אותם לריבוד בארבע מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים בחושך.
אפשרו לשתילים לגדול בתנאי יום ארוכים עם השקיה קבועה, ולאחר מכן לקטוף צמחים בגודל ובגיל דומים כדי לבצע את חיסון טבילת השורשים. מוציאים את האדמה מהסירים וחופרים את השורשים. יש לשטוף בעדינות את השורשים במיכל מים ולהרחיק את הרוזטות מהמים.
דגירה של השורשים במשך 60 דקות בצלחת פטרי המכילה את תמיסת נבג הקודקודים או תמיסת דמה. מכינים סירים חדשים עם אדמה מעוקרת אדים לחה ללא חול. השתמשו בקצה פיפטה כדי ליצור חור במרכז האדמה בכל סיר.
מכניסים את השורשים ישירות לתוך החור וממלאים את החורים בעדינות באדמה כדי למנוע עקה נוספת לצמחים. מטפחים את הצמחים בתנאי יום ארוכים עם השקיה קבועה. בצע את הניתוחים בנקודות הזמן המועדפות לאחר החיסון.
במערכת המבוססת על צלחת פטרי, זיהום מוצלח של קודקודים הודגם בשורשי הערבידופסיס. יומיים לאחר החיסון, גן הסמן MYB51 הושרה מאוד בשורשים נגועים בהשוואה לבקרה, אשר אושרה על ידי ניתוח QRTPCR. במערכת המבוססת על כוסות, כמות גבוהה של דנ"א פטרייתי נמצאה בעלים של צמחים נגועים כפי שמראה הגרף בהשוואה לבקרה מדומה לאחר 12 ימי חיסון.
ניתוח QRTPCR הראה שפע תעתיק מועשר של גן הסמן MYB51 בשורשי הערבידופסיס. באמצעות מערכת זו חוסן הקודקודים למיני צמחים אחרים. באונס זרעי שמן, ניתן היה לזהות את הדנ"א הפטרייתי במקטעי גזע שנחתכו בבסיס השתילים 12 יום לאחר חיסון השורשים.
דנ"א פטרייתי זוהה גם בגבעולים של עגבניות המצביע על התפשטות הפתוגן בתוך הצמח. 21 יום לאחר החיסון באמצעות המערכת מבוססת הקרקע, הרוזטות של צמחי ערבידופסיס מדומים שטופלו נראו בריאות וירוקות בעוד שצמחים נגועים הראו עלים צהבהבים או נמקיים והיו להם שטח עלים ירוקים פחות יחסית ללעג המעיד על זיהום מוצלח. שימו לב בעת חיתוך תעלת הזיהום במערכת כלי הפטרי כדי למנוע מהאגר להחליק.
ביישום המערכת מבוססת הקרקע, אין לדחוס את האדמה סביב השורשים תוך כדי עיקור מחדש כדי למנוע עקה נוספת על הצמחים. לאחר חיסון השורשים, למשל, ניתן לבצע בדיקות פתוגניות, ניתוח של ביטוי גנים, גנומיקה תפקודית או בדיקות אגרוכימיות המספקות תובנות חדשות על אינטראקציות של חיידקי שורש וכלים לשיפור החקלאות.
