سيوضح هذا البروتوكول تنفيذ وتحسين الفحص المجهري SRS للتركيز الطيفي وكيف يمكن استخدامه في تطبيقات أنسجة رامان المحفزة في الوقت الفعلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السرعة التي يمكن بها معالجة العينات بمجرد محاذاة الأجهزة بشكل صحيح ، حيث لا يتطلب SRS معالجة الأنسجة وتلطيخها. ينطبق هذا البروتوكول على تطبيقات SRS الأخرى ، ولا يقتصر فقط على علم الأنسجة.
وتشمل هذه التطبيقات الجزيئات الصغيرة والأدوية والخلايا والأنسجة. ابدأ بتركيب زوج من العدسات اللونية لشعاع المضخة لتكبير حجم شعاع الليزر بمقدار ضعفين كنقطة بداية. ضع عدسة 100 و 200 ملم على بعد 300 ملم تقريبا من بعضها البعض.
ثم قم بمحاذاة شعاع المضخة من خلال مركز كلتا العدستين. بعد ذلك ضع مرآة بعد العدسة الثانية لإرسال الشعاع نحو جدار على بعد أكثر من متر واحد. تتبع الشعاع من المرآة إلى الحائط باستخدام بطاقة الأشعة تحت الحمراء وتحقق مما إذا كان الشعاع يتغير في الحجم.
قم بتجميع الشعاع إذا تغير حجم الشعاع كدالة للمسافة. اجمع بين شعاعي الليزر عن طريق تثبيت مرآة ثنائية اللون مع العديد من مرايا التوجيه للتعديل. تحسين التداخل المكاني للمضخة وستوكس من خلال مراقبة الحزم بعد المرآة ثنائية اللون في موقعين مختلفين يفصل بينهما متر واحد.
اضبط مرآة التوجيه بشكل متكرر متبوعة بالمرآة ثنائية اللون لمحاذاة شعاع ستوكس مع شعاع المضخة. تأكد من إرسال الحزم المدمجة إلى وسط مرايا المسح الضوئي للمجهر الضوئي بالليزر عن طريق ضبط زوج من مرايا التوجيه عندما تكون مرايا المسح الضوئي في وضع التوقف. بعد المكثف ، استخدم زوجا آخر من العدسات بأطوال بؤرية تبلغ 100 ملم و 30 ملم ، على التوالي ، لنقل الحزمة المرسلة إلى الصمام الثنائي الضوئي ، مما يضمن احتواء كلا الحزمتين داخل الصمام الثنائي الضوئي.
ثم قم بتثبيت اثنين من مرشحات التمرير المنخفض لحجب شعاع ستوكس المعدل. ضع جهاز أخذ عينات الشعاع في مسار شعاع ستوكس لالتقاط 10٪ من الشعاع وإرساله إلى صمام ثنائي ضوئي سريع للكشف عن قطار النبض 80 ميجاهرتز. خذ أحد مخرجات المخزن المؤقت للمروحة وقم بتصفيته باستخدام مرشح تمرير النطاق للحصول على موجة جيبية 20 ميجاهرتز.
ثم استخدم مخفف RF لضبط ذروة الإخراج إلى ذروة الجهد إلى حوالي 500 مللي فولت. أرسل الناتج الناتج إلى محول الطور ، والذي يسمح بالتعديل الدقيق لمرحلة RF باستخدام مصدر الجهد. أرسل هذا الإخراج إلى مضخم طاقة RF وقم بتوصيل خرج مكبر الصوت ب EOM.
بعد إلغاء حظر شعاع ستوكس، قم بتحسين عمق التشكيل لأول EOM عن طريق وضع صمام ثنائي ضوئي في مسار الحزمة. اضبط جهد EOM ولوحة الموجة الربعية حتى يبدو عمق التشكيل مرضيا. ضع صودا ضوئيا بعد المرآة ثنائية اللون للكشف عن شعاع الليزر.
قم بحظر شعاع ستوكس أولا، ثم قم بتكبير إحدى قمم نبض المضخة على منظار الذبذبات. ضع مؤشرا رأسيا لتحديد الموضع الزمني لهذه الذروة باستخدام منظار الذبذبات. الآن قم بحظر شعاع المضخة ، وقم بإلغاء حظر شعاع ستوكس.
ترجم مرحلة التأخير لمطابقة مواضع الذروة على منظار الذبذبات مؤقتا إلى الموضع المحدد في الخطوة السابقة. عن طريق حساب مسافة التأخير المطلوبة لمطابقة الحزمتين متبوعة بإطالة مسار الحزمة للشعاع الأسرع أو تقصير مسار الشعاع للشعاع الأبطأ. بعد ذلك قم بإعداد عينة شريحة مجهرية باستخدام DMSO وشريط على الوجهين كفاصل لحمل العينة بين الشريحة والغطاء الانزلاقي.
ضع العينة على المجهر مع جانب الغطاء المواجه لهدف المجهر وراقب العينة من القطعة I تحت إضاءة الحقل الساطع. أوجد تركيز العينة في كل من الطبقة العلوية والسفلية من فقاعات الهواء في واجهة الشريط الزجاجي، ثم حرك التركيز البؤري ليكون بين طبقتي الشريط. بعد ذلك ، اضبط خرج الشعاع القابل للضبط على 798 نانومتر.
استنادا إلى الإنتاجية البصرية للمكثف، اضبط الطاقة البصرية لتكون حوالي 40 مللي واط لكل من المضخة وحزم ستوكس عند التركيز الموضوعي. ثم افتح صورة المسح الضوئي في MATLAB وانقر على الزر المسمى التركيز لبدء المسح الضوئي. اضبط مرآة التوجيه قبل الماسح الضوئي galvo لتوسيط إشارة التيار المستمر على شاشة القناة الأولى.
حرك مرحلة التأخير الآلية وراقب عن كثب مخرجات القفل المعروضة على شاشة القناة الثانية. أخيرا ، اضبط التأخير الزمني لزيادة كثافة إشارة التيار المتردد. اضبط المرآة ثنائية اللون لتوسيط إشارة SRS على قناة التيار المتردد.
ثم اضبط مرحلة مضخم الصوت القفل لزيادة الإشارة إلى أقصى حد. بعد تركيب شريحة العينة على المجهر وضبط قوة كلا الحزمتين إلى حوالي 40 مللي واط لكل منهما عند تركيز العينة كما هو موضح سابقا. افتح صورة المسح الضوئي من MATLAB.
ثم ابحث عن إشارة SRS القصوى عن طريق المسح الضوئي خلال مرحلة التأخير المقابلة لقمة رامان 2،913 سنتيمتر عكسي من DMSO. احصل على صورة SRS المقابلة لقمة رامان 2،913 سنتيمتر عكسي من DMSO. افتح الصورة في ImageJ وحدد مساحة صغيرة في وسط الإطار.
استخدم دالة القياس لحساب المتوسط والانحراف المعياري للقيم في المنطقة المحددة. لمعايرة الوصول إلى التردد، احفظ مسحا الطيفيا فائق مع نطاق مرحلة التأخير الذي يغطي قمم رامان المعكوسة 2 و913 و2 994 سنتيمترا من DMSO. ثم احفظ مواضع المرحلة المقابلة لمجموعة البيانات فائقة الطيف.
قم بإجراء الانحدار الخطي لمواضع المسرح وتحولات رامان عند 2 و 913 و 2 994 سنتيمترا عكسيا. باستخدام معادلة الانحدار الخطي ، قم بتحويل مواضع التأخير إلى ترددات رامان المقابلة. لمعايرة الاستبانة الطيفية ، قم بتقدير موضع المرحلة بناء على الموضع السابق مع زيادة طول المسار البصري بسبب إدخال قضبان.
أعد محاذاة التداخل المكاني للحزم بسبب الانحراف الطفيف للشعاع عند إضافة قضبان زجاجية. قم بتثبيت فاصل شعاع استقطابي ، ولوحة ربع موجة ، و EOM ثان في مسار شعاع النقع بعد EOM الأول. افصل إدخال الإشارة بوحدة EOM الثانية، ثم قم بتوصيل إدخال الإشارة بوحدة EOM الأولى، وقم بتشغيله.
قم بتعديل شعاع ستوكس عند 20 ميجاهرتز عن طريق إرسال الشعاع عبر أول EOM. اضبط إمالة وموضع EOM الأول لضمان تمركز الشعاع عبر بلورة EOM. قم بإعداد عينة شريحة الأنسجة باستخدام شريط على الوجهين وشريحة مجهر وغطاء زجاجي.
ضع العينة على المجهر مع جانب الغطاء المواجه لهدف المجهر. لتصوير SRS في وضع epi ، قم بتثبيت لوحة نصف موجة قبل دخول الشعاع إلى المجهر لتغيير استقطاب الحزمة التي تدخل المجهر. ضع مقسم شعاع استقطاب فوق الهدف للسماح للشعاع المنعكس الخلفي غير المستقطب بالوصول إلى الكاشف.
بعد ذلك ، استخدم عدسة أكرومات 75 ملم وعدسة شبه كروية 30 ملم لنقل الفوتونات المتناثرة الخلفية من الفتحة الخلفية للهدف إلى كاشف الصور. قم بتركيب الكاشف لجمع الضوء المتناثر الخلفي الموجه بواسطة مقسم شعاع الاستقطاب. ثم قم بتثبيت مرشح لمنع الشعاع المعدل من دخول الكاشف.
يؤثر تغيير أطوال القضبان على الدقة الطيفية. عندما لا يتم استخدام قضبان النقيق الزجاجية ، لا يتم حل قمتي رامان من DMSO على الإطلاق. تبدأ الزيادة في عدد قضبان النقيق الزجاجية في حل القمتين عند نقطة مرضية.
النقيق المطابق يحل كلا القمتين ويمكن استخدامه لمعايرة مواضع المرحلة إلى التردد. يظهر قطاران نبضيان متأخران زمنيا من الاستقطاب المتعامد المستخدم لتصوير أطياف DMSO التأخير الزمني بين الإثارة SRS مع عمق التشكيل المقبول والفصل الزمني. في المقابل ، يؤدي التحول الضعيف في مرحلة SRS بلونين إلى قمم مقلوبة أو سلبية.
في الوقت الحقيقي ، يتم عرض تصويرين SRS ملونين في 2 و 850 و 2 و 930 سنتيمترا عكسيا من أنسجة دماغ الفئران خارج الجسم الحي هنا. تم ترميز صور الدهون والبروتين الخام بالألوان لإنتاج صورة واحدة تصور مساهمات الدهون والبروتين. كما تم إجراء إعادة تلوين الهيماتوكسيلين والإيوسين الكاذبين لتقليد تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للتطبيقات المرضية.
يعد التداخل الزمني المكاني وتحسين الدقة المكانية أهم الخطوات لنهج التركيز المكاني ل SRS. تنطبق هذه الطريقة بشكل عام على تجارب الفحص المجهري الأخرى لمسبار المضخة مثل الفحص المجهري للامتصاص العابر. تسمح هذه الطريقة أيضا بتصوير الجزيئات غير الفلورية في الخلايا والأنسجة.
الطريقة المعروضة هنا تسرع وقت الحصول على الصور للترجمة المستقبلية لأنسجة رامان المحفزة في العيادة.
