Este protocolo demostrará la implementación y optimización de la microscopía SRS de enfoque espectral y cómo se puede utilizar para aplicaciones de histología Raman estimulada en tiempo real. La principal ventaja de esta técnica es la velocidad a la que se pueden procesar las muestras una vez que la instrumentación está correctamente alineada, ya que SRS no requiere procesamiento y tinción de tejidos. Este protocolo es aplicable a otras aplicaciones de SRS, no solo a la histología.
Tales aplicaciones incluyen moléculas pequeñas, medicamentos, células y tejidos. Comience instalando un par de lentes acromáticas para el haz de la bomba para aumentar el tamaño del rayo láser por dos veces como punto de partida. Coloque una lente de 100 y 200 milímetros a aproximadamente 300 milímetros entre sí.
A continuación, alinee el haz de la bomba a través del centro de ambas lentes. A continuación, coloque un espejo después de la segunda lente para enviar el haz hacia una pared a más de un metro de distancia. Traza el haz desde el espejo hasta la pared con una tarjeta IR y comprueba si el haz cambia de tamaño.
Colimar el haz si el haz cambia de tamaño en función de la distancia. Combine los dos rayos láser instalando un espejo dicroico con varios espejos de dirección para su ajuste. Optimice la superposición espacial de la bomba y Stokes mediante la monitorización de haces después del espejo dicroico en dos posiciones diferentes a un metro de distancia.
Ajuste iterativamente el espejo de dirección seguido del espejo dicroico para alinear el haz stokes con el haz de la bomba. Asegúrese de que los haces combinados se envíen al centro de los espejos de escaneo del microscopio de escaneo láser ajustando un par de espejos de dirección cuando los espejos de escaneo estén en la posición estacionada. Después del condensador, use otro par de lentes con distancias focales de 100 milímetros y 30 milímetros, respectivamente, para retransmitir el haz transmitido al fotodiodo, asegurando que ambos haces estén contenidos dentro del fotodiodo.
A continuación, instale dos filtros de paso bajo para bloquear el haz stokes modulado. Coloque un muestreador de haz en la trayectoria del haz stokes para recoger el 10% del haz y enviarlo a un fotodiodo rápido para detectar el tren de pulsos de 80 megahercios. Tome una de las salidas del búfer de fanout y filtre con un filtro de paso de banda para obtener una onda sinusoidal de 20 megahercios.
Luego use un atenuador de RF para ajustar el pico de salida al voltaje máximo a aproximadamente 500 milivoltios. Envíe la salida resultante a una palanca de cambios de fase, que permite un ajuste fino de la fase de RF con una fuente de voltaje. Envíe esta salida a un amplificador de potencia de RF y conecte la salida del amplificador a la MOE.
Después de desbloquear el haz de Stokes, optimice la profundidad de modulación de la primera MOE colocando un fotodiodo en la trayectoria del haz. Ajuste el voltaje EOM y la placa de cuarto de onda hasta que la profundidad de modulación parezca satisfactoria. Coloque un fotodiodo después del espejo dicroico para detectar el rayo láser.
Bloquee primero el haz de Stokes, luego amplíe uno de los picos de pulso de la bomba en el osciloscopio. Coloque un cursor vertical para marcar la posición temporal de este pico con el osciloscopio. Ahora bloquee el haz de la bomba y desbloquee el haz de Stokes.
Traduzca la etapa de retardo para que coincida temporalmente con las posiciones máximas del osciloscopio con la posición marcada en el paso anterior. Calculando la distancia de retardo requerida para que coincida con los dos haces seguido de alargar la trayectoria del haz del haz más rápido o acortar la trayectoria del haz del haz más lento. A continuación, prepare una muestra de diapositiva de microscopio con DMSO y cinta adhesiva de doble cara como espaciador para mantener la muestra entre la diapositiva y una cubierta.
Coloque la muestra en el microscopio con el lado de la lata hacia el objetivo del microscopio y observe la muestra de la pieza I bajo iluminación de campo brillante. Busque el foco de la muestra en la capa superior e inferior de burbujas de aire en la interfaz de la cinta de vidrio, luego mueva el foco para que esté entre las dos capas de la cinta. A continuación, ajuste la salida del haz sintonizable a 798 nanómetros.
En función del rendimiento óptico del condensador, ajuste la potencia óptica para que sea de aproximadamente 40 milivatios cada uno para la bomba y los haces stokes en el foco objetivo. A continuación, abra escanear imagen en MATLAB y haga clic en el botón etiquetado enfoque para comenzar a escanear. Ajuste el espejo de dirección antes del escáner galvo para centrar la señal de CC en la pantalla del canal uno.
Mueva la etapa de retardo motorizado y observe de cerca la salida de bloqueo que se muestra en la pantalla del canal dos. Finalmente, ajuste el retardo de tiempo para maximizar la intensidad de la señal de CA. Ajuste el espejo dicroico para centrar la señal SRS en el canal de CA.
A continuación, ajuste la fase del amplificador de bloqueo para maximizar la señal. Después de montar la muestra, portaobjetos en el microscopio y ajustando la potencia de ambos haces a aproximadamente 40 milivatios cada uno en el foco de la muestra, como se demostró anteriormente. Abra la imagen de escaneo desde MATLAB.
Luego encuentre la señal SRS máxima escaneando a través de la etapa de retardo correspondiente al pico Raman de 2, 913 centímetros inversos de DMSO. Adquiera una imagen SRS correspondiente al pico Raman de 2, 913 centímetros inversos de DMSO. Abra la imagen en ImageJ y seleccione un área pequeña en el centro del marco.
Utilice la función de medida para calcular la media y la desviación estándar de los valores en el área seleccionada. Para la calibración de acceso de frecuencia, guarde una exploración hiperespectral con el rango de etapa de retardo que cubre los picos Raman de 2, 913 y 2, 994 centímetros inversos de DMSO. A continuación, guarde las posiciones de escenario correspondientes al conjunto de datos hiperespectrales.
Realice regresión lineal para las posiciones de etapa y cambios Raman a 2, 913 y 2, 994 centímetros inversos. Usando la ecuación de regresión lineal, convierta las posiciones de retardo a las frecuencias Raman correspondientes. Para la calibración de la resolución espectral, estime la posición de la etapa en función de la posición anterior con el aumento de la longitud de la trayectoria óptica debido a la inserción de varillas.
Realinear la superposición espacial de las vigas debido a la ligera desviación de la viga cuando se agregan varillas de vidrio. Instale un divisor de haz polarizador, una placa de cuarto de onda y una segunda MOE en la trayectoria del haz de remojo después de la primera MOE. Desenchufe la entrada de señal a la segunda MOE, luego conecte la entrada de señal a la primera MOE y enciéndala.
Modula el haz de Stokes a 20 megahercios enviando el haz a través de la primera MOE. Ajuste la inclinación y la posición de la primera MOE para asegurarse de que el haz esté centrado a través del cristal de la MOE. Prepare una muestra de portaobjetos de tejido con cinta adhesiva de doble cara, portaobjetos de microscopio y vidrio de cubierta.
Coloque la muestra en el microscopio con el lado de la cubierta hacia el objetivo del microscopio. Para las imágenes SRS en modo epi, instale una placa de media onda antes de que el haz entre en el microscopio para cambiar la polarización del haz que entra en el microscopio. Coloque un divisor de haz polarizador sobre el objetivo para permitir que el haz reflejado trasero despolarizado llegue al detector.
A continuación, use una lente de acromato de 75 milímetros y una lente asférica de 30 milímetros para transmitir los fotones dispersos posteriores desde la apertura posterior del objetivo al fotodetector. Monte el detector para recoger la luz dispersa trasera dirigida por el divisor de haz polarizador. A continuación, instale un filtro para impedir que el haz modulado entre en el detector.
Variar las longitudes de las varillas afecta la resolución espectral. Cuando no se utilizan varillas de chirrido de vidrio, los dos picos Raman de DMSO no se resuelven en absoluto. Un aumento en el número de varillas de canto de vidrio comienza a resolver los dos picos en un punto satisfactorio.
El canto emparejado resuelve ambos picos y se puede usar para calibrar las posiciones del escenario a la frecuencia. Dos trenes de pulsos retardados en el tiempo de polarización ortogonal utilizados para obtener imágenes de espectros DMSO muestran el retraso de tiempo entre las excitaciones SRS con profundidad de modulación aceptable y separación temporal. En contraste, un mal cambio de fase SRS de dos colores, da lugar a picos invertidos o negativos.
Aquí se muestran imágenes SRS de dos colores en tiempo real a 2, 850 y 2, 930 centímetros inversos de tejido cerebral de ratón ex vivo. Las imágenes de lípidos y proteínas en bruto se codificaron por colores para producir una sola imagen que representara las contribuciones de lípidos y proteínas. También se realizaron falsos recoloreos de hematoxilina y eosina para imitar la tinción de hematoxilina y eosina para aplicaciones patológicas.
La superposición espacio-temporal y la optimización de la resolución espacial son los pasos más importantes para el enfoque de enfoque espacial de SRS. Este método es generalmente aplicable para otros experimentos de microscopía de sonda de bomba, como la microscopía de absorción transitoria. El método también permite obtener imágenes de moléculas no fluorescentes en células y tejidos.
El método presentado aquí acelera el tiempo de adquisición de imágenes para la futura traducción de la histología Raman estimulada en la clínica.
