بروتوكولات زراعة الكلاب العضوية الكبدية والمعوية مهمة لتوحيد هذه التكنولوجيا الجديدة. تسمح هذه التقنية بإنشاء موثوق به وقابل للتكرار لثقافة الكلاب العضوية بما في ذلك العزل العضوي والصيانة والحصاد والبنوك الحيوية اللاحقة للعينات. يمكن أن توفر عضويات الكلاب نموذجا ممتازا للعديد من التطبيقات التي تمتد من البيولوجيا ، وتطوير الأمراض المعدية ، واختبار الأدوية واكتشافها ، وكذلك أدوية الانتقال.
للبدء ، قم بإعداد خمسة أنابيب طرد مركزي 15 ملليلتر مع خمسة ملليلترات من محلول مخلب كامل 1X ، وأنبوب واحد مع ثلاثة ملليلترات من محلول مخلب كامل 1X ، وأنبوب فارغ واحد ، وأنبوب واحد مع خمسة ملليلتر من محلول مخلب كامل 1X ، وملليلتر من مصل البقر الجنيني. في يوم العزل ، ضع طبق بتري معقم ومشرط ودلو ثلج وخليط مغذيات DMEM متقدم بارد F12 في خزانة السلامة الأحيائية. ضع العدد المطلوب من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لتسخينها مسبقا.
ضع مصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة على الجليد للذوبان. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى أربع درجات مئوية. انقل الوسائط الكاملة مع عوامل النمو من الفريزر إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لتجنب التعرض المباشر للضوء.
رج عينات الأنسجة في أنبوب النقل لمدة 30 ثانية. قم بإزالة السوبرناتانت المفرط دون التخلص من أي أنسجة عن طريق السحب البطيء بالقرب من سطح السائل حتى يتم ترك 0.5 ملليلتر في الأنبوب. انقل الأنسجة وبقايا السوبرنات إلى طبق بتري معقم.
باستخدام مشرط يمكن التخلص منه ، قم بتقطيع الأنسجة وفرمها إلى قطع أصغر تشبه قوام الهريس لمدة خمس دقائق تقريبا. قم بتقطيع الأنسجة المفرومة بالسائل من طبق بتري إلى أول أنبوب محلول مخلبي كامل ، ثم أضف ملليلترين من خليط المغذيات DMEM المتقدم F12 إلى طبق بتري. اغسل الأنسجة المتبقية وانقلها إلى أول أنبوب محلول مخلب كامل.
دوامة أنبوب محلول مخلب كامل 1X حوالي خمس مرات لمدة خمس ثوان. اسمح للخزعات بالاستقرار في قاع الأنبوب لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة supernatant حتى يتم ترك خمسة ملليلترات. انقل محلول المخلب الكامل 1X من الأنبوب الجديد إلى أنبوب العينة.
كرر الخطوة السابقة للأنبوبين التاليين. وفي الغسلتين الأخيرتين ، قم بإزالة supernatant إلى ثلاثة ملليلتر المتبقية في الأنبوب. انقل الخزعات ومحلول مخلب كامل 1X من أنبوب العينة إلى بئر واحد من صفيحة من ستة آبار.
أضف ثلاثة ملليلترات من محلول مخلب كامل 1X إلى أنبوب العينة. تدور بلطف لجمع أي أنسجة متبقية ونقلها إلى نفس البئر من اللوحة. أضف 150 ميكرولتر من 0.5 حمض رباعي أسيتيك الإيثيلين ديامين المولي في بئر وضع الصفيحة المكونة من ستة آبار على هزاز 20 درجة و 24 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية.
احتضان عينات الكبد لمدة 10 دقائق والعينات المعوية لمدة ساعة واحدة على الروك المتحرك. انقل الصفيحة المكونة من ستة آبار مرة أخرى إلى خزانة السلامة الأحيائية وانقل الأنسجة المفرومة والسائل إلى أنبوب يحتوي على محلول مخلب كامل 1X مع مصل بقري جنيني. اسمح للأنسجة بالاستقرار ونقل السوبرناتانت مع 0.2 ملليلتر من الجزء العلوي من الأنسجة إلى أنبوب فارغ.
قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على العينة عند 700 XG لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. يتم الآن تكوير الخلايا الجذعية جنبا إلى جنب مع الأنسجة المفرومة. قم بإزالة والتخلص من supernatant بعناية حتى لا تزعج الكرية.
أعد تعليق الكريات في DMEM F12 المتقدم. قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى وقم بشفط supernatant دون إزعاج الكرية. أضف الحجم المحسوب لمصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة إلى أنبوب العينة.
كن حذرا عند إزالة الوسائط حتى لا تفقد حبيبات الخلية. عند إضافة مصفوفة غشاء خارج الخلية ، ماصة ببطء لعدم إنشاء فقاعات مفرطة في التعليق العضوي. احتفظ بالعينة مع مصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة على الجليد وزرع التعليق في منتصف الآبار بحيث تشكل مصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة بنية تشبه القبة.
انقل اللوحة إلى حاضنة واسمح لمصفوفة الغشاء خارج الخلية المذابة بالتصلب لمدة 30 دقيقة. امزج مثبط ROCK و GSK3 beta في وسائط كاملة مع عوامل النمو وأضف 500 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة.
عادة ما يولد بروتوكول الكلاب العضوي حوالي 50،000 إلى 150،000 خلية معوية أو كبدية لكل بئر. بعد عزل الخلايا الجذعية ، تبدأ عضويات الكلاب الكبدية دورة حياتها ككرويات موسعة ، وبعد سبعة أيام ، تتحول إلى عضويات ناشئة ومميزة. تم حساب الحجم ومساحة السطح ومنطقة القطع الناقص 2D ومحيط الكرويات.
تم استخدام منطقة القطع الناقص 2D ومحيطها لتقييم صحة الثقافة العضوية. أظهر تقييم التعبير عن العلامات بطريقة شبه كمية أن الكرويات عبرت بشكل تفضيلي عن علامة الخلايا الصفراوية KRT7 التي تتراوح من واحد إلى 26٪ تراوح تعبير علامة الخلايا الجذعية LGR5 بين 0.17 و 0.78٪ في حين تم التعبير عن علامات خلايا الكبد إلى حد أقل عند 0.05 إلى 0.34٪ لصندوق الرأس الشوكي 1A و 0.03 إلى 0.28٪ للسيتوكروم-P450. لم تمنع الحضانة لمدة 12 دقيقة مع البروتياز الشبيه بالتريبسين نمو المواد العضوية.
ومع ذلك ، تأثر نمو المواد العضوية سلبا باستخدام حضانة لمدة 24 دقيقة. تم تحليل قدرة الأعضاء الكبدية الكلاب على البقاء في بيئة غير مواتية لتحديد حجم الوسائط العضوية ومصفوفة الطابق السفلي اللازمة للنمو الناجح للعضويات الكبدية وبقائها. تراوح معدل البقاء على قيد الحياة من المواد العضوية من 12.9 يوما إلى 18 يوما.
تقنيات زراعة الخلايا الأساسية والنهج المعقمة هي المتطلبات الأساسية للعزل العضوي السليم والصيانة.
