イヌの肝臓および腸内オルガノイドの培養のためのプロトコルは、この新規技術を標準化するために重要である。この技術は、オルガノイドの単離、維持、収穫、およびその後のサンプルのバイオバンキングを含む、イヌオルガノイド培養の信頼性が高く再現可能な確立を可能にする。犬オルガノイドは、生物学、感染症開発、薬物検査と発見、そして伝染医学にまたがる多数の用途のための優れたモデルを提供することができます。
まず、5ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む5つの15ミリリットル遠沈管、3ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む1つのチューブ、1つの空のチューブ、および5ミリリットルの1X完全キレート溶液を含む1つのチューブ、および2ミリリットルのウシ胎児血清を準備する。単離の日に、滅菌ペトリ皿、メス、アイスバケツ、および冷たい高度なDMEM栄養素混合物F12をバイオセーフティキャビネットに入れます。必要数の24穴細胞培養プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、予備加温する。
融解のために可溶化した細胞外膜マトリックスを氷上に置く。遠心分離機を摂氏4度に予冷します。直接光への暴露を避けて、成長因子を含む完全な培地を冷凍庫から摂氏37度の水浴に移す。
輸送管内の組織サンプルを30秒間振盪する。0.5ミリリットルがチューブ内に残るまで、流体表面の近くでゆっくりとピペッティングすることによって、組織を捨てることなく過剰な上清を除去する。組織および残りの上清を滅菌ペトリ皿に移す。
使い捨てメスを使用して、組織を切断し、マッシュの一貫性に似た小さな断片に約5分間細かく刻む。ペトリ皿からの液体でミンチ組織を最初の完全なキレート溶液チューブにピペットし、次いで2ミリリットルの高度なDMEM栄養混合物F12をペトリ皿に加える。残りの組織をフラッシュし、最初の完全なキレート溶液チューブに移す。
1X完全キレート溶液チューブを5秒間約5回ボルテックスします。生検をチューブの底に1分間沈降させ、5ミリリットルが残るまで上清を除去する。1X完全キレート溶液を新しいチューブからサンプルチューブに移します。
次の 2 本のチューブについて、前の手順を繰り返します。そして最後の2回の洗浄で、チューブに残っている3ミリリットルまで上清を取り除きます。生検および1X完全キレート溶液をサンプルチューブから6ウェルプレートの1ウェルに移す。
3ミリリットルの1X完全キレート溶液をサンプルチューブに加える。静かに旋回して残りの組織を収集し、プレートの同じウェルに移します。ウェルに150マイクロリットルの0.5モルエチレンジアミン四酢酸を加え、6ウェルプレートを摂氏4度の20度24RPMロッカー上に置きます。
肝臓サンプルを10分間、腸サンプルを移動ロッカー上で1時間インキュベートする。6ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに戻し、ミンチ組織と液体をウシ胎児血清を含む1X完全キレート溶液を含むチューブに移します。組織が沈降し、組織の上部の0.2ミリリットルで上清を空のチューブに輸送する。
サンプルを入れたチューブを700 XGで4°Cで5分間スピンダウンします。幹細胞は現在、ミンチ組織とともにペレット化されている。ペレットを乱さないように上澄み液を慎重に取り除いて捨てます。
ペレットを高度なDMEM F12に再懸濁する。チューブを再び回転させ、ペレットを乱すことなく上清を吸引する。可溶化された細胞外膜マトリックスの計算された体積をサンプル管に加える。
細胞ペレットを失わないように培地を除去するときは注意してください。細胞外膜マトリックスを添加する場合、ピペットはオルガノイド懸濁液中に過剰な気泡を生じないようにゆっくりとする。可溶化された細胞外膜マトリックスを含むサンプルを氷上に保管し、可溶化された細胞外膜マトリックスがドーム様構造を形成するように、ウェルの中央に懸濁液を播種する。
プレートをインキュベーターに輸送し、可溶化された細胞外膜マトリックスを30分間固化させる。ROCK阻害剤およびGSK3ベータを成長因子を含む完全な培地で混合し、この溶液を500マイクロリットルをすべてのウェルに加える。プレートをインキュベーターに入れます。
イヌオルガノイドプロトコルは、典型的には、ウェル当たり約50,000〜150,000個の腸細胞または肝細胞を生成する。幹細胞単離後、肝臓犬オルガノイドは拡大スフェロイドとしてライフサイクルを開始し、7日後には出芽および分化オルガノイドに変わります。回転楕円体の体積、表面積、2D楕円領域、および円周を計算した。
2D楕円領域および円周を使用して、オルガノイド培養の健康状態を評価した。半定量的様式でのマーカーの発現の評価は、スフェロイドが1〜26%の範囲の胆管細胞マーカーKRT7を優先的に発現することを示した幹細胞マーカーLGR5発現は0.17〜0.78%の範囲であったが、肝細胞マーカーはフォークヘッドボックス1Aでは0.05〜0.34%、シトクロム−P450では0.03〜0.28%と低い程度に発現していた。トリプシン様プロテアーゼとの12分間のインキュベーションは、オルガノイド増殖を阻害しなかった。
しかし、オルガノイドの成長は、24分間のインキュベーションを使用して悪影響を受けました。不利な環境におけるイヌ肝オルガノイドの生存率を分析して、肝臓オルガノイドの成長と生存を成功させるために必要なオルガノイド培地および地下マトリックスの量を決定した。オルガノイドの生存率は12.9日から18日の範囲であった。
基本的な細胞培養技術と無菌アプローチは、適切なオルガノイドの単離と維持に不可欠な前提条件です。
