Die Protokolle für die Kultur von Leber- und Darmorganoiden bei Hunden sind wichtig für die Standardisierung dieser neuartigen Technologie. Diese Technik ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Etablierung der Organoidkultur des Hundes, einschließlich der Organoidisolierung, Wartung, Ernte und anschließenden Biobankierung von Proben. Canine Organoide können ein hervorragendes Modell für zahlreiche Anwendungen bieten, die von der Biologie über die Entwicklung von Infektionskrankheiten, die Arzneimittelprüfung und -entdeckung bis hin zur Übertragungsmedizin reichen.
Bereiten Sie zunächst fünf 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit fünf Millilitern 1X kompletter Chelatlösung, ein Röhrchen mit drei Millilitern 1X kompletter Chelatlösung, ein leeres Röhrchen und ein Röhrchen mit fünf Millilitern 1X kompletter Chelatlösung und zwei Milliliter fetalem Rinderserum vor. Stellen Sie am Tag der Isolierung eine sterile Petrischale, ein Skalpell, einen Eiskübel und eine kalte fortschrittliche DMEM-Nährstoffmischung F12 in die Biosicherheitskabine. Legen Sie die erforderliche Anzahl von 24-Well-Zellkulturplatten in den Kohlendioxid-Inkubator, um sich vorzuwärmen.
Legen Sie die gelöste extrazelluläre Membranmatrix zum Auftauen auf Eis. Die Zentrifuge auf vier Grad Celsius vorkühlen. Bewegen Sie komplette Medien mit Wachstumsfaktoren aus dem Gefrierschrank in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung.
Schütteln Sie Gewebeproben im Transportröhrchen für 30 Sekunden. Entfernen Sie übermäßigen Überstand, ohne Gewebe zu verwerfen, indem Sie langsam in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche pipettieren, bis 0,5 Milliliter in der Röhre verbleiben. Gewebe und Restgut in eine sterile Petrischale überführen.
Schneiden Sie das Gewebe mit einem Einwegskalpell und zerkleinern Sie es etwa fünf Minuten lang in kleinere Stücke, die einer Maischekonsistenz ähneln. Das gehackte Gewebe mit Flüssigkeit aus der Petrischale in das erste komplette Chelatlösungsröhrchen pipettieren und dann zwei Milliliter fortschrittliche DMEM-Nährstoffmischung F12 in die Petrischale geben. Das restliche Gewebe spülen und in das erste komplette Chelatlösungsröhrchen überführen.
Wirbeln Sie das 1X komplette Chelatlösungsröhrchen etwa fünfmal für fünf Sekunden auf. Lassen Sie Biopsien eine Minute lang am Boden der Röhre absetzen und entfernen Sie den Überstand, bis fünf Milliliter übrig sind. Übertragen Sie die 1X komplette Chelatlösung aus dem neuen Röhrchen in das Probenröhrchen.
Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für die folgenden beiden Röhren. Und entfernen Sie bei den letzten beiden Wäschen den Überstand auf drei Milliliter, die in der Röhre verbleiben. Übertragen Sie die Biopsien und 1X komplette Chelatlösung aus dem Probenröhrchen in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
Fügen Sie dem Probenröhrchen drei Milliliter 1X komplette Chelatlösung hinzu. Vorsichtig schwenken, um das verbleibende Gewebe zu sammeln und in den gleichen Brunnen der Platte zu gelangen. Fügen Sie 150 Mikroliter 0,5 molare Ethylendiamintetraessigsäure in eine Vertiefung und legen Sie die Sechs-Well-Platte auf eine 20 Grad 24 U / min Wippe bei vier Grad Celsius.
Inkubieren Sie die Leberproben für 10 Minuten und die Darmproben für eine Stunde auf der beweglichen Wippe. Transportieren Sie die Sechs-Well-Platte zurück zur Biosicherheitskabine und geben Sie das gehackte Gewebe und die Flüssigkeit in ein Röhrchen, das 1X komplette Chelatlösung mit fetalem Rinderserum enthält. Lassen Sie das Gewebe absetzen und transportieren Sie den Überstand mit 0,2 Millilitern des oberen Teils des Gewebes zu einem leeren Röhrchen.
Drehen Sie das Röhrchen, das die Probe bei 700 XG enthält, fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius durch. Stammzellen werden nun zusammen mit dem gehackten Gewebe pelletiert. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, um das Pellet nicht zu stören.
Resuspendiert das Pellet in fortschrittlichem DMEM F12. Drehen Sie das Rohr erneut und saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören. Addieren Sie das berechnete Volumen der solubilisierten extrazellulären Membranmatrix zum Probenröhrchen.
Seien Sie vorsichtig beim Entfernen von Medien, um das Zellpellet nicht zu verlieren. Wenn Sie eine extrazelluläre Membranmatrix hinzufügen, pipettieren Sie langsam, um keine übermäßigen Blasen in der Organoidsuspension zu erzeugen. Halten Sie die Probe mit der gelösten extrazellulären Membranmatrix auf Eis und säen Sie die Suspension in der Mitte der Vertiefungen aus, so dass die solubilisierte extrazelluläre Membranmatrix eine kuppelartige Struktur bildet.
Transportieren Sie die Platte in einen Inkubator und lassen Sie die solubilisierte extrazelluläre Membranmatrix 30 Minuten lang erstarren. Mischen Sie ROCK-Inhibitor und GSK3 beta in vollständigen Medien mit Wachstumsfaktoren und fügen Sie 500 Mikroliter dieser Lösung zu jeder Vertiefung hinzu. Legen Sie die Platte in den Inkubator.
Das Organoidprotokoll des Hundes erzeugt typischerweise etwa 50.000 bis 150.000 Darm- oder Leberzellen pro Well. Nach der Isolation von Stammzellen beginnen Leberkrebs-Organoide ihren Lebenszyklus als expandierende Sphäroide, und nach sieben Tagen verwandeln sie sich in knospende und differenzierende Organoide. Das Volumen, die Oberfläche, die 2D-Ellipsenfläche und der Umfang der Sphäroide wurden berechnet.
2D-Ellipsenfläche und -umfang wurden verwendet, um die Gesundheit der Organoidkultur zu beurteilen. Die Beurteilung der Expression der Marker in semiquantitativer Weise zeigte, dass die Sphäroide bevorzugt den Cholangiozytenmarker KRT7 im Bereich von eins bis 26% exprimiertenDer Stammzellmarker LGR5 Expression lag zwischen 0,17 und 0,78%, während Hepatozytenmarker in geringerem Maße bei 0,05 bis 0,34% für Forkhead Box 1A und 0,03 bis 0,28% für Cytochrom-P450 exprimiert wurden. Eine 12-minütige Inkubation mit Trypsin-ähnlicher Protease hemmte das Organoidwachstum nicht.
Das Wachstum von Organoiden wurde jedoch durch eine 24-minütige Inkubation negativ beeinflusst. Die Überlebensfähigkeit von hundeförmigen Leberorganoiden in einer ungünstigen Umgebung wurde analysiert, um das Volumen der Organoidmedien und der Kellermatrix zu bestimmen, die für das erfolgreiche Wachstum und Überleben der Leberorganoide benötigt werden. Die Überlebensrate von Organoiden reichte von 12,9 Tagen bis 18 Tagen.
Grundlegende Zellkulturtechniken und aseptische Ansätze sind die wesentlichen Voraussetzungen für eine ordnungsgemäße Isolierung und Wartung von Organoiden.
