송곳니 간 및 장 오가노이드의 배양을위한 프로토콜은이 새로운 기술을 표준화하는 데 중요합니다. 이 기술은 샘플의 오가노이드 분리, 유지 보수, 수확 및 후속 바이오 뱅킹을 포함하여 송곳니 오가노이드 배양의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 확립을 허용합니다. 송곳니 오가노이드는 생물학, 전염병 개발, 약물 테스트 및 발견, 또한 전염 의학에 이르기까지 수많은 응용 분야에 대한 훌륭한 모델을 제공 할 수 있습니다.
시작하려면 5 밀리리터의 1X 완전 킬레이트 용액이있는 5 개의 15 밀리리터 원심 분리 튜브, 1X 완전 킬레이트 용액 3 밀리리터가있는 튜브 1 개, 빈 튜브 1 개, 1X 완전 킬레이트 용액 5 밀리리터가있는 튜브 1 개, 태아 소 혈청 2 밀리리터를 준비하십시오. 격리 당일에는 멸균 페트리 접시, 메스, 얼음 양동이 및 차가운 고급 DMEM 영양 혼합물 F12를 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오. 필요한 수의 24-웰 세포 배양 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 예열한다.
해동을 위해 가용화된 세포외 막 매트릭스를 얼음 위에 놓는다. 원심 분리기를 섭씨 네 도까지 미리 식히십시오. 성장 인자가있는 전체 매체를 냉동실에서 섭씨 37도 수조로 옮겨 직접 빛에 노출되지 않도록하십시오.
조직 샘플을 수송 튜브에서 30초 동안 흔든다. 0.5 밀리리터가 튜브에 남을 때까지 유체 표면 근처에서 천천히 피펫팅하여 조직을 버리지 않고 과도한 상층액을 제거하십시오. 조직과 남아있는 상등액을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.
일회용 메스를 사용하여 조직을 자르고 약 다섯 분 동안 매쉬 일관성을 닮은 작은 조각으로 다듬습니다. 다진 조직을 페트리 접시에서 액체로 피펫팅하여 첫 번째 완전한 킬레이트 용액 튜브로 피펫 한 다음 2 밀리리터의 고급 DMEM 영양 혼합물 F12를 페트리 접시에 첨가하십시오. 나머지 조직을 플러시하고 첫 번째 완전한 킬레이트 용액 튜브로 옮깁니다.
1X 완전 킬레이트 용액 튜브를 다섯 초 동안 약 다섯 번 볼텍스합니다. 생검이 튜브 바닥에 한 분 동안 침전되도록 허용하고 다섯 밀리리터가 남을 때까지 상층액을 제거하십시오. 1X 완전 킬레이트 용액을 새 튜브에서 샘플 튜브로 옮깁니다.
다음 두 튜브에 대해 이전 단계를 반복합니다. 그리고 마지막 두 번의 세척에서 튜브에 남아있는 세 밀리리터까지 상층액을 제거하십시오. 생검 및 1X 완전 킬레이트 용액을 샘플 튜브로부터 여섯 웰 플레이트의 한 웰로 옮긴다.
세 밀리리터의 1X 완전 킬레이트 용액을 샘플 튜브에 첨가하십시오. 부드럽게 소용돌이 치며 남아있는 조직을 수집하고 플레이트의 동일한 웰로 옮깁니다. 우물에 0.5 몰 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 150 마이크로 리터를 넣고 섭씨 4도에서 20도 24RPM 로커에 여섯 웰 플레이트를 놓습니다.
간 샘플을 10분 동안 인큐베이션하고, 장 샘플을 움직이는 로커 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 여섯 웰 플레이트를 다시 생물안전 캐비닛으로 운반하고 다진 조직과 액체를 태아 소 혈청이 있는 1X 완전 킬레이트 용액을 함유하는 튜브로 옮깁니다. 조직이 침전되고 조직의 상부 부분의 0.2 밀리리터로 상층액을 빈 튜브로 운반하도록하십시오.
샘플이 들어있는 튜브를 섭씨 네 도에서 5분 동안 700 XG에서 회전시킵니다. 줄기 세포는 이제 다진 조직과 함께 펠릿화됩니다. 펠렛을 방해하지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
펠렛을 고급 DMEM F12에 재현탁시킨다. 튜브를 다시 회전시키고 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인한다. 가용화된 세포외 막 매트릭스의 계산된 부피를 샘플 튜브에 첨가한다.
배지를 제거할 때 세포 펠릿을 잃지 않도록 주의하십시오. 세포외 막 매트릭스를 첨가할 때, 피펫은 오가노이드 현탁액 내에 과도한 기포를 생성하지 않도록 천천히 한다. 가용화된 세포외 막 매트릭스를 갖는 샘플을 얼음 위에 보관하고 현탁액을 웰의 중간에 시드하여 가용화된 세포외 막 매트릭스가 돔형 구조를 형성하도록 한다.
플레이트를 인큐베이터로 운반하고 가용화된 세포외 막 매트릭스가 30분 동안 응고되도록 한다. ROCK 억제제와 GSK3 베타를 성장 인자와 함께 완전한 배지에 혼합하고 모든 웰에이 용액 500 마이크로 리터를 첨가하십시오. 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다.
송곳니 오가노이드 프로토콜은 전형적으로 웰 당 대략 50, 000 내지 150, 000개의 장 또는 간 세포를 생성한다. 줄기 세포 분리 후, 간 송곳니 오가노이드는 구상체를 확장시키는 것으로 수명주기를 시작하고, 칠일 후, 그들은 싹을 틔우고 분화시키는 오가노이드로 변합니다. 구상체의 부피, 표면적, 2D 타원 영역 및 둘레를 계산하였다.
2D 타원 영역 및 둘레를 사용하여 오가노이드 배양물의 건강을 평가하였다. 반정량적 방식으로 마커의 발현을 평가한 결과, 구상체가 우선적으로 1 내지 26%에 이르는 담관세포 마커 KRT7을 발현한 것으로 나타났고, 줄기세포 마커인 LGR5 발현은 0.17 내지 0.78% 사이인 반면, 간세포 마커는 포크헤드 박스 1A의 경우 0.05 내지 0.34%로 낮은 정도로 발현되었고, 시토크롬-P450의 경우 0.03 내지 0.28%로 더 낮은 정도로 발현되었다. 트립신-유사 프로테아제와 함께 12분 인큐베이션한 결과, 오가노이드 성장을 억제하지 않았다.
그러나, 오가노이드의 성장은 24분 인큐베이션을 사용하여 부정적인 영향을 받았다. 불리한 환경에서 송곳니 간 오가노이드의 생존 가능성을 분석하여 간 오가노이드의 성공적인 성장과 생존에 필요한 오가노이드 배지 및 기저 매트릭스의 부피를 결정했습니다. 오가노이드의 생존율은 12.9 일에서 18 일 사이였습니다.
기본적인 세포 배양 기술과 무균 접근법은 적절한 오가노이드 분리 및 유지를위한 필수 전제 조건입니다.
