يسمح لنا هذا البروتوكول باستخدام عدد أقل من القراد مما يقلل من تكلفة صيانة المستعمرة ويقلل من عدد الحيوانات الفقرية اللازمة لتغذية القراد. يتطلب هذا البروتوكول حوالي 20 علامة. ومع ذلك ، فإن الميزة الرئيسية بصرف النظر عن استخدام حجم عينة صغير هي أنه يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع متعددة من القراد ومراحل حياة مختلفة.
بصرف النظر عن تشريح القراد أو التطبيق نحو التفاعلات بين المضيف والطفيلي ، فإن تأثير العدوى المسببة للأمراض على إفراز microRNA وتأثير التغيرات الفسيولوجية على microRNA التي تفرزها القراد. للبدء ، قم بإعداد وسائط خالية من الحويصلات عن طريق إضافة مصل البقر الجنيني ، ومرق فوسفات التربتوز ، وتركيز الكوليسترول في البروتين الدهني بنسبة 10٪ ، وبيكربونات الصوديوم بنسبة 5٪ ، و HEPES ، ووسط L15C300 إلى زجاجة طرد مركزي من البولي كربونات سعة 26.3 ملليلتر وضبط الحجم حسب الحاجة. الآن الطرد المركزي الفائق الوسط في 100،000 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة.
قم بإزالة السوبرناتانت بعناية دون إزعاج الكريات ونقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي جديد. جهاز الطرد المركزي الفائق للأنبوب مرة أخرى. خذ السوبر نات ومرره عبر مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الملوثات.
قم بتقطيع المادة الفائقة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الحاجة أو حتى ثلاث سنوات. أضف كمية مناسبة من المضادات الحيوية إلى 500 ميكرولتر من الوسط الخالي من الحويصلات في كل بئر من صفيحة زراعة 24 بئرا. الآن ، أضف PBS مع ريفامبيسين إلى الآبار التي لا تحتوي على وسط خال من الحويصلة لمنع نمو البكتيريا.
ضع القراد على شريحة زجاجية بشريط سجاد على الوجهين تحت مجهر تشريح. قبل التشريح ، أضف PBS الذي يحتوي على ريفامبيسين إلى القراد وباستخدام مقص Vannas بأربعة ملليمترات ، قم بعمل شق يبلغ حوالي ملليمتر واحد على جانب كل أنثى. الآن ، قم بإزالة الجانب الظهري للقراد والغدد اللعابية ، ثم ضع 20 إلى 40 غدة لعابية من القراد في 500 ميكرولتر من الوسط الخالي من الحويصلات المضافة إلى بئر واحد في لوحة معالجة بزراعة الأنسجة من 24 بئرا.
احتضان عينات الغدة اللعابية عند 32 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح بإفراز الحويصلات خارج الخلية. في نهاية الحضانة ، ماصة جميع الوسائط التي تحتوي على الغدد اللعابية في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 300 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.
أعد تعليق الكريات التي تحتوي على الغدد اللعابية في الحمض النووي الريبي لاحقا وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم استخدامها أو إلى أجل غير مسمى. الآن ، قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي للجهاز الفائق عند 2000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق وماصة السوبرنات في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة الأجسام الماصة والحويصلات الأكبر خارج الخلية ونقل supernatant إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 ملليلتر.
ثم قم بتجميع مرشح حقنة نايلون ميكرومتر واحد على حقنة 10 ملليلتر واحتفظ بها على أنبوب جهاز طرد مركزي فائق. ثم أضف العينة واملأ المحقنة ب 10 ملليلتر من PBS. مرر السوبرناتانت من خلال المرشح إلى الأنبوب.
بعد تصفية الأنابيب وموازنتها ، ضعها في دوار 70 Ti وقم بطرد الأنابيب بسرعة 100،000 مرة G لمدة 18 ساعة عند أربع درجات مئوية. تشكل الحويصلات المركزة خارج الخلية حبيبة بعد الطرد المركزي الفائق. قم بإزالة supernatant دون إزعاج الكريات وإعادة تعليق الكريات في PBS.
ماصة 500 ميكرولتر من الحويصلة خارج الخلية في مرشح طرد مركزي 300 K وأجهزة طرد مركزي في 8،000 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة الحرارة المحيطة وكرر هذا الإجراء حتى يتم ترشيح جميع الحويصلات خارج الخلية. أخيرا ، أضف 400 ميكرولتر من PBS المعقم إلى العمود واخلطه جيدا لإزالة الحويصلات خارج الخلية المرتبطة بالغشاء. ثم ضع العينة في أنبوب خال من الحمض النووي الريبي 1.5 ملليلتر.
اختلف تركيز وحجم الحويصلات خارج الخلية اعتمادا على الجنس ومرحلة حياة القراد بين النسخ المتماثلة البيولوجية للإناث والذكور والحوريات. بالنسبة لجميع النسخ المتماثلة البيولوجية مجتمعة ، لوحظت نتائج مماثلة. أظهر تحليل الحمض النووي الريبي الصغير المعزول من الغدة اللعابية نطاقات مقابلة للحمض النووي الريبوسومي والحمض النووي الريبوزومي الميكروي.
ومع ذلك، كانت الحمض النووي الريبوسومي الريبوسومي غائبة في الحويصلات المعزولة من الغدد اللعابية، وأظهرت عينات الحمض النووي الريبوزي الميكروي التي تم تنقيتها من الحويصلات خارج الخلية المزيد من التدهور. بعد التخصيب، أظهرت عينات الحمض النووي الريبي الميكروي التي تم تنقيتها من المركبات الكهربائية الحد الأدنى من التحلل وتركيز الحمض النووي الريبي الميكروي الكافي لتخليق مكتبة cDNA. حجم النطاق المتوقع من حوالي 150 زوجا أساسيا بعد الحصول على إعداد مكتبة cDNA يدل على مكتبات cDNA صغيرة الحمض النووي الريبي.
أثناء التحضير الخالي من الحويصلات ، تأكد من اتباع الخطوات لمنع تلوث الحويصلة الخارجية. أثناء إعداد لوحة جيدة ، تأكد من إضافة المضادات الحيوية لمنع التلوث البكتيري من ميكروبيوم القراد. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي الميكروي المستخرج باستخدام هذا البروتوكول للتنميط والتجارب الوظيفية للتحقق من صحة أدوار الحمض النووي الريبي الميكروي مثل التنبؤ بأهداف مسار الحمض النووي الريبي الميكروي والتثبيط وتجارب المحاكاة.
