Este protocolo nos permite usar um número reduzido de carrapatos que reduz o custo de manutenção da colônia e diminui o número de animais vertebrados necessários para a alimentação de carrapatos. Este protocolo requer aproximadamente 20 carrapatos. No entanto, a principal vantagem além de usar um pequeno tamanho amostral é que este protocolo pode ser aplicado a múltiplas espécies de carrapatos e diferentes estágios de vida.
Além das dissecções de carrapatos ou da aplicação para interações hospedeira-parasita, o efeito da infecção por patógenos na secreção de microRNA e o efeito das alterações fisiológicas no microRNA secretados por carrapatos. Para começar, prepare a mídia sem vesícula adicionando soro bovino fetal, broto de fosfato de tryptose, concentrado de colesterol de lipoproteína de 10%, 5% de bicarbonato de sódio, HEPES e meio L15C300 em uma garrafa de centrífuga de policarbonato de 26,3 mililitros e ajuste o volume conforme necessário. Agora ultracentrize o meio a 100.000 vezes G a quatro graus Celsius por 18 horas.
Remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota e transfira o supernatante para um tubo de centrífuga fresco. Ultracentrizar o tubo mais uma vez. Pegue o supernascer e passe por um filtro de 0,22 micrômetro para remover contaminantes.
Pipeta o supernante em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e armazene-o a menos 20 graus Celsius até que seja necessário ou até três anos. Adicione uma quantidade apropriada de antibióticos a 500 microliters do meio livre de vesículas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Agora, adicione PBS com rifampicina aos poços que não contêm meio livre de vesículas para evitar o crescimento bacteriano.
Coloque os carrapatos em um slide de vidro com fita adesiva de dois lados sob um microscópio dissecando. Antes da dissecção, adicione PBS contendo rifampicina ao carrapato e usando uma tesoura vannas de quatro milímetros, faça uma incisão de aproximadamente um milímetro ao lado de cada fêmea. Agora, remova o lado dorsal do carrapato e as glândulas salivares, em seguida, coloque 20 a 40 glândulas salivares de carrapato em 500 microliters de meio livre de vesícula adicionado a um único poço em uma placa tratada de cultura tecidual de 24 poços.
Incubar as amostras da glândula salivar a 32 graus Celsius durante 24 horas para permitir a secreção das vesículas extracelulares. No final da incubação, pipeta todo o meio contendo as glândulas salivares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrífuga a 300 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Resuspenha a pelota contendo as glândulas salivares no RNA mais tarde e armazene a menos 80 graus Celsius até ser usada ou indefinidamente. Agora, remova os detritos celulares centrifugando o supernadante a 2.000 vezes G a 4 graus Celsius por 10 minutos e pipeta o supernascido em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrífuga a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover corpos apoptóticos e vesículas extracelulares maiores e transferir o supernatante para um tubo fresco de microcentrífugo de 1,5 mililitro.
Em seguida, monte um filtro de seringa de nylon de um micrômetro em uma seringa de 10 mililitros e mantenha-a em um tubo ultracentrífuga. Em seguida, adicione a amostra e encha a seringa com 10 mililitros de PBS. Passe o sobrenatante através do filtro para dentro do tubo.
Depois de filtrar e equilibrar os tubos, coloque-os em um rotor de 70 Ti e ultracentrize os tubos a 100.000 vezes G durante 18 horas a quatro graus Celsius. As vesículas extracelulares concentradas formam uma pelota após a ultracentrifugação. Remova o supernatante sem perturbar a pelota e resuspense a pelota na PBS.
Pipeta 500 microliters da vesícula extracelular em um filtro centrífugo de 300 K e centrífuga a 8.000 vezes G por 10 minutos a temperatura ambiente e repita este procedimento até que todas as vesículas extracelulares sejam filtradas. Por fim, adicione 400 microliters de PBS esterilizados à coluna e misture bem para remover vesículas extracelulares ligadas à membrana. Em seguida, coloque a amostra em um tubo livre DNAase RNAse de 1,5 mililitro.
A concentração e o tamanho das vesículas extracelulares variaram dependendo do sexo e da fase de vida dos carrapatos entre as réplicas biológicas para fêmeas, machos e ninfas. Para todas as réplicas biológicas combinadas, foram observados resultados semelhantes. A análise de pequenas RNAs isoladas da glândula salivar mostrou bandas correspondentes ao RNA ribossômico e microRNAs.
No entanto, os RNAs ribossômicos estavam ausentes nas vesículas isoladas das glândulas salivares, e amostras de microRNA purificadas de vesículas extracelulares mostraram mais degradação. Após o enriquecimento, as amostras de microRNA purificadas dos EVs mostraram degradação mínima e concentração de microRNA suficiente para síntese da biblioteca cDNA. O tamanho esperado da banda de aproximadamente 150 pares de base após a preparação da biblioteca cDNA significa pequenas bibliotecas cDNA RNA.
Durante a preparação sem vesículas, certifique-se de seguir os passos para evitar a contaminação externa da vesícula. Durante a preparação da placa, certifique-se de adicionar antibióticos para evitar a contaminação bacteriana do microbioma do carrapato. As microRNAs extraídas usando este protocolo podem ser usadas para perfis e experimentos funcionais para validar funções de microRNA, como prever alvos de via microRNA, inibição e experimentos de imitação.
