Este protocolo nos permite utilizar un número reducido de garrapatas, lo que reduce el costo de mantenimiento de la colonia y disminuye el número de vértebras necesarias para la alimentación de garrapatas. Este protocolo requiere aproximadamente 20 ticks. Sin embargo, la principal ventaja, aparte de usar un tamaño de muestra pequeño, es que este protocolo se puede aplicar a múltiples especies de garrapatas y diferentes etapas de la vida.
Aparte de las disecciones de garrapatas o la aplicación hacia las interacciones huésped-parásito, el efecto de la infección por patógenos en la secreción de microARN y el efecto de los cambios fisiológicos en el microARN secretado por las garrapatas. Para comenzar, prepare medios libres de vesículas agregando suero bovino fetal, caldo de fosfato de triptosa, concentrado de colesterol de lipoproteína al 10%, bicarbonato de sodio al 5%, HEPES y medio L15C300 en una botella centrífuga de policarbonato de 26.3 mililitros y ajuste el volumen según sea necesario. Ahora ultracentrifugar el medio a 100, 000 veces G a cuatro grados centígrados durante 18 horas.
Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet y transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga nuevo. Ultracentrifugar el tubo una vez más. Tome el sobrenadante y páselo a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar los contaminantes.
Pipetear el sobrenadante en un tubo de centrífuga de 50 mililitros y almacenarlo a menos 20 grados centígrados hasta que sea necesario o hasta tres años. Agregue una cantidad apropiada de antibióticos a 500 microlitros del medio libre de vesículas en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos. Ahora, agregue PBS con rifampicina a los pocillos que no contienen medio libre de vesículas para prevenir el crecimiento bacteriano.
Coloque las garrapatas en un portaobjetos de vidrio con cinta de alfombra de doble cara bajo un microscopio de disección. Antes de la disección, agregue PBS que contenga rifampicina a la garrapata y usando unas tijeras Vannas de cuatro milímetros, haga una incisión de aproximadamente un milímetro en el lado de cada hembra. Ahora, retire el lado dorsal y las glándulas salivales de la garrapata, luego coloque de 20 a 40 glándulas salivales de garrapatas en 500 microlitros de medio libre de vesículas agregado a un solo pocillo en una placa tratada con cultivo de tejido de 24 pocillos.
Incubar las muestras de glándulas salivales a 32 grados centígrados durante 24 horas para permitir la secreción de las vesículas extracelulares. Al final de la incubación, pipetear todo el medio que contiene las glándulas salivales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugar a 300 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Vuelva a suspender el pellet que contiene las glándulas salivales en ARN más tarde y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se use o indefinidamente. Ahora, retire los desechos celulares centrifugando el sobrenadante a 2, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante 10 minutos y pipetear el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros. A continuación, centrifugar a 10, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los cuerpos apoptóticos y vesículas extracelulares más grandes y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros.
Luego ensamble un filtro de jeringa de nylon de un micrómetro en una jeringa de 10 mililitros y manténgalo en un tubo de ultracentrífuga. Luego agregue la muestra y llene la jeringa con 10 mililitros de PBS. Pase el sobrenadante a través del filtro hasta el tubo.
Después de filtrar y equilibrar los tubos, colóquelos en un rotor de 70 Ti y ultracentrifugar los tubos a 100, 000 veces G durante 18 horas a cuatro grados centígrados. Las vesículas extracelulares concentradas forman un gránulo después de la ultracentrifugación. Retire el sobrenadante sin alterar el pellet y vuelva a suspender el pellet en PBS.
Pipetear 500 microlitros de la vesícula extracelular en un filtro centrífugo de 300 K y centrifugar a 8, 000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente y repetir este procedimiento hasta que se filtren todas las vesículas extracelulares. Finalmente, agregue 400 microlitros de PBS esterilizado a la columna y mezcle bien para eliminar las vesículas extracelulares unidas a la membrana. Luego coloque la muestra en un tubo libre de ARNasa de ADN de 1.5 mililitros.
La concentración y el tamaño de las vesículas extracelulares variaron dependiendo del género y la etapa de vida de las garrapatas entre las réplicas biológicas para hembras, machos y ninfas. Para todas las réplicas biológicas combinadas, se observaron resultados similares. El análisis de pequeños ARN aislados de la glándula salival mostró bandas correspondientes a ARN ribosómico y microARN.
Sin embargo, los ARN ribosómicos estaban ausentes en las vesículas aisladas de las glándulas salivales, y las muestras de microARN purificadas de vesículas extracelulares mostraron más degradación. Después del enriquecimiento, las muestras de microARN purificadas de EV mostraron una degradación mínima y una concentración suficiente de microARN para la síntesis de la biblioteca de ADNc. El tamaño de banda esperado de aproximadamente 150 pares de bases después de que se obtuvo la preparación de la biblioteca de ADNc significa pequeñas bibliotecas de ADNc de ARN.
Durante la preparación sin vesículas, asegúrese de seguir los pasos para evitar la contaminación de vesículas externas. Durante la preparación del pozo, asegúrese de agregar antibióticos para prevenir la contaminación bacteriana del microbioma de la garrapata. Los microARN extraídos utilizando este protocolo se pueden utilizar para la elaboración de perfiles y experimentos funcionales para validar las funciones del microARN, como la predicción de objetivos de la vía del microARN, la inhibición y los experimentos de mimetismo.
