제안된 DNA 분리 방법은 자가면역질환 마우스 모델에서 장내 미생물 역학을 연구하는 역할을 할 수 있습니다. 시판되는 키트에 필적하는 분변 샘플로부터 DNA를 얻기 위해 보다 다재다능하고 비용 효율적이며 효율적인 방법이 제안된다. 시작하려면 각 마우스를 케이지에서 개별적으로 꺼내 항문에서 직접 대변 펠릿을 수집하고 처리 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
멸균되고 깨끗한 집게, 튜브 및 장갑으로 샘플을 처리하십시오. 미리 계량 된 2 밀리리터 스크류 캡 튜브에 냉동 펠릿을 추가하고 분변 중량을 그램 단위로 기록하면 분변 펠릿 당 0.02-0.05 그램 사이 여야합니다. 펠릿에 0.1mm 유리 비드, 500 마이크로 리터의 용해 완충액 및 200 마이크로 리터의 20 % 나트륨 도데 실 설페이트의 얇은 층을 추가하십시오.
비드는 균질화기에서 4분 동안 튜브를 두들긴 다음 3-5분 동안 볼텍싱을 했습니다. 기포와 거품을 제거하기 위해 짧은 시간 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 미생물군 샘플에서 DNA를 추출하려면 350마이크로리터의 샘플 상청액을 파편 없이 새로운 1.5밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.
500마이크로리터의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 25:24:1의 비율로 추가하고 1분 동안 와동시킵니다. 원심분리 후, 180 마이크로리터의 상부 수성 상을 새로운 1.5 밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮긴다. 180 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 뒤집어 혼합하십시오.
이로부터 180 마이크로 리터의 수성 상을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 생물 안전 캐비닛에 180 마이크로 리터의 차가운 이소프로판올과 36 마이크로 리터의 5 몰 암모늄 아세테이트를 추가하십시오. 몇 번 뒤집어 혼합하고 튜브를 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.
상청액을 버리고, 펠렛을 500 마이크로리터의 차가운 70%에탄올로 수회 세척하였다. 상청액을 버리고 펠릿이 깨끗해질 때까지 20분 동안 티슈 페이퍼에 튜브를 거꾸로 자연 건조시킵니다. 펠릿을 50마이크로리터의 분자 등급 물에 현탁하고 액체를 섭씨 37도에서 10분 동안 가열하여 큰 DNA 펠릿을 완전히 용해시킵니다.
가열 후,이 튜브를 3, 400 배 G에서 1 분 동안 원심 분리하여 뚜껑에서 응축 방울을 회수하십시오. 농도를 측정하고, 분광 광도계를 사용하여 260/280 비를 구한다. 양질의 DNA에 대한 비율은 일반적으로 1.8과 2 사이입니다.
준비된 샘플을 실온에서 1분 동안 600배 G로 원심분리한 후 섭씨 영하 80도에서 24시간 동안 동결시킨다. 그런 다음 시퀀싱을 위해 마이크로리터당 1에서 50나노그램 범위의 농도를 가진 20마이크로리터의 샘플을 아르곤 국립 연구소로 보냅니다. 수용체 CX3CR1이 결여된 마우스 균주는 야생형 MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP 마우스와 비교하여 장내 미생물 구성이 다르며, 특정 속에서 유의미한 차이를 보이며, 이는 프로테오박테리아 문과 같은 잠재적 병원성 박테리아와 관련이 있습니다.
시료 오염에 주의하십시오. 그것은 멸균되어야합니다. 또한 상청액을 새 튜브로 옮길 때 정확하게 피펫팅하는 것이 중요합니다.
이 방법은 PCR, 제한 효소 소화 또는 게놈 라이브러리 구성과 같은 분자 분석에 적합합니다. 루푸스에서 우리는 장내 미생물총과 루푸스 진행 사이에 강한 관계가 있음을 입증했습니다.
