ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית

שיטת בידוד הדנ"א המוצעת יכולה לשמש לחקר הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של עכברי מחלות אוטואימוניות. שיטה רב-תכליתית, חסכונית ויעילה יותר מוצעת להשגת דנ"א מדגימות צואה הדומות לערכות הזמינות מסחרית. כדי להתחיל, להוציא כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו, לאסוף כדור צואה ישירות מפי הטבעת ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.

מעבדים את הדגימות בעזרת מלקחיים, צינורות וכפפות סטריליים ונקיים. הוסף גלולה קפואה לצינור מכסה בורג במשקל שני מיליליטר שנשקל מראש, ורשום את משקל הצואה בגרמים, שאמור להיות בין 0.02 ל -0.05 גרם לכל כדור צואה. הוסיפו לכדור שכבה דקה של חרוזי זכוכית בקוטר 0.1 מילימטר, 500 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ו-200 מיקרוליטרים של 20% נתרן דודציל סולפט.

חרוז היכה את הצינור במשך ארבע דקות בהומוגנייזר, ואחריו שלוש עד חמש דקות של מערבולת. צנטריפוגה את הצינורות לזמן קצר כדי לחסל את הבועות ואת הקצף. כדי לחלץ דנ"א מדגימות המיקרוביוטה, העבירו 350 מיקרוליטרים של דגימה-על לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, ללא כל פסולת.

הוסף 500 מיקרוליטר של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל, ביחס של 25:24:1, ומערבולת במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה, העבירו 180 מיקרוליטרים של הפאזה המימית העליונה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 180 מיקרוליטרים של כלורופורם, הופכים ומערבבים.

מכאן, להעביר 180 microliters של הפאזה המימית לתוך צינור כובע הצמדה חדש. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו 180 מיקרוליטרים של איזופרופנול קר ו-36 מיקרוליטרים של חמישה אצטט אמוניום טוחן. הפוך אותו כמה פעמים כדי לערבב, והנח את הצינור על קרח במשך 20 דקות.

להשליך את supernatant, ואחריו לשטוף את הכדורים מספר פעמים עם 500 microliters של 70% אתנול קר. יש להשליך את הסופר-נט, ולייבש את הצינור במהופך על נייר טישו במשך 20 דקות, עד שהכדור מתבהר. יש להשעות את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של מים ברמה מולקולרית, ולחמם את הנוזל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להמיס באופן מלא כדורי דנ"א גדולים.

לאחר החימום, צנטריפוגות אלה ב 3, 400 פעמים G במשך דקה אחת כדי לשחזר את טיפות העיבוי מן המכסה. מדוד את הריכוז, וקבל את היחס 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. היחס לדנ"א באיכות טובה הוא בדרך כלל בין 1.8 לשניים.

צנטריפוגה של דגימות מוכנות ב 600 פעמים G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, לפני קפיאה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, שלח 20 מיקרוליטרים של דגימות בריכוזים הנעים בין 1 ל-50 ננוגרם למיקרוליטר למעבדה הלאומית של ארגון לריצוף. לזן העכבר חסר הקולטן CX3CR1 יש הרכב מיקרוביוטה שונה של המעיים בהשוואה לעכברי MRL/lpr מסוג פראי, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, מראה הבדלים משמעותיים בסוגים מסוימים, הרלוונטיים לחיידקים פתוגניים פוטנציאליים כמו אלה שבגוף פרוטאובקטריה.

היזהר עם זיהום המדגם. זה צריך להיות סטרילי. כמו כן, חשוב פיפטינג עם דיוק בעת העברת supernatant בצינור חדש.

שיטה זו מתאימה לאנליזה מולקולרית כגון PCR, עיכול אנזימי הגבלה או בניית ספרייה גנומית. בזאבת הוכחנו קשר חזק בין מיקרוביוטה של המעיים לבין התקדמות זאבת.