Предложенный метод выделения ДНК может служить для изучения динамики кишечной микробиоты в аутоиммунных заболеваниях мышиных моделей. Предлагается более универсальный, экономичный и эффективный метод получения ДНК из образцов фекалий, которые сопоставимы с коммерчески доступными наборами. Для начала выньте каждую мышь индивидуально из своей клетки, соберите фекальную гранулу прямо из ануса и храните ее при минус 80 градусах Цельсия до тех пор, пока она не будет обработана.
Обработайте образцы стерильными и чистыми щипцами, трубками и перчатками. Добавьте замороженную гранулу в предварительно взвешенную двухмиллитровую шнековую колпачок и запишите вес фекалий в граммах, который должен составлять от 0,02 до 0,05 г на фекальную гранулу. Добавьте к грануле тонкий слой стеклянных шариков размером 0,1 миллиметра, 500 микролитров лизисного буфера и 200 микролитров 20% додецилсульфата натрия.
Шарик взбивает трубку в течение четырех минут в гомогенизаторе, а затем три-пять минут вихря. Центрифугируйте трубки на короткое время, чтобы устранить пузырьки и пену. Чтобы извлечь ДНК из образцов микробиоты, перенесите 350 микролитров образца супернатанта в новую, 1,5 миллилитра защелкивающуюся колпачковую трубку, без какого-либо мусора.
Добавьте 500 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта в соотношении 25:24:1 и вихрь в течение одной минуты. После центрифугирования переведите 180 микролитров верхней водной фазы в новую, 1,5-миллилитровую трубку с защелкивающейся крышкой. Добавьте 180 микролитров хлороформа, инвертируйте и перемешайте.
Из этого переведите 180 микролитров водной фазы в новую трубку с защелкивающимся колпачком. В шкаф биобезопасности добавьте 180 микролитров холодного изопропанола и 36 микролитров пяти молярного ацетата аммония. Переверните его несколько раз, чтобы перемешать, и поместите трубку на лед на 20 минут.
Откажитесь от супернатанта с последующим промывкой гранул несколько раз 500 микролитрами холодного 70%-го этанола. Выбросьте супернатант, и высушите на воздухе трубку вверх ногами на папиросной бумаге в течение 20 минут, пока гранула не станет прозрачной. Суспендировать гранулу в 50 микролитрах молекулярной воды и нагревать жидкость при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы полностью растворить крупные гранулы ДНК.
После нагрева центрифугируйте эти трубки в 3, 400 раз G в течение одной минуты, чтобы извлечь капли конденсации из крышки. Измерьте концентрацию и получите соотношение 260/280 с помощью спектрофотометра. Соотношение для ДНК хорошего качества обычно составляет от 1,8 до двух.
Центрифугируют подготовленные образцы в 600 раз G в течение одной минуты при комнатной температуре, перед замораживанием при минус 80 градусах Цельсия в течение 24 часов. Затем отправьте 20 микролитров образцов с концентрациями от одного до 50 нанограмм на микролитр в Аргоннскую национальную лабораторию для секвенирования. Штамм мыши, не имеющий рецептора CX3CR1, имеет другой состав кишечной микробиоты по сравнению с мышами MRL/lpr дикого типа, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, показывает значительные различия в определенных родах, относящихся к потенциально патогенным бактериям, таким как протеобактерии типа.
Будьте осторожны с загрязнением образца. Он должен быть стерильным. Также важна пипетка с точностью при переносе супернатанта в новую трубку.
Этот метод подходит для молекулярного анализа, такого как ПЦР, переваривание ферментов рестрикции или построение геномной библиотеки. При волчанке мы доказали сильную связь между микробиотой кишечника и прогрессированием волчанки.
