提案されたDNA単離法は、自己免疫疾患マウスモデルにおける腸内細菌叢の動態を研究するのに役立ちます。市販のキットに匹敵する糞便サンプルからDNAを取得するために、より用途が広く、費用効果が高く、効率的な方法が提案されています。まず、各マウスをケージから個別に取り出し、肛門から直接糞便ペレットを収集し、処理されるまで摂氏マイナス80度で保管します。
滅菌済みの清潔な鉗子、チューブ、手袋でサンプルを処理します。冷凍ペレットを事前に計量した2ミリリットルのスクリューキャップチューブに追加し、糞便ペレットあたり0.02〜0.05グラムの糞便重量をグラム単位で記録します。ペレットに、0.1ミリメートルのガラスビーズ、500マイクロリットルの溶解バッファー、および200マイクロリットルの20%ドデシル硫酸ナトリウムの薄層を加える。
ビーズをホモジナイザーで4分間チューブを叩き、続いて3〜5分間ボルテックスします。チューブを短時間遠心分離して、気泡や泡を取り除きます。微生物叢サンプルからDNAを抽出するには、350マイクロリットルのサンプル上清を、破片のない新しい1.5ミリリットルのスナップキャップチューブに移します。
500マイクロリットルのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを25:24:1の比率で加え、1分間ボルテックスします。遠心分離後、180マイクロリットルの上部水相を新しい1.5ミリリットルのスナップキャップチューブに移します。180マイクロリットルのクロロホルムを加え、反転させて混合する。
これから、180マイクロリットルの水相を新しいスナップキャップチューブに移します。バイオセーフティキャビネットに、180マイクロリットルの冷たいイソプロパノールと36マイクロリットルの5モル酢酸アンモニウムを加えます。数回ひっくり返して混ぜ、チューブを氷の上に20分間置きます。
上清を捨て、500マイクロリットルの冷70%エタノールでペレットを数回洗浄した。上清を捨て、ペレットが透明になるまで、ティッシュペーパー上でチューブを逆さまにして20分間風乾します。ペレットを50マイクロリットルの分子グレードの水に懸濁し、液体を摂氏37度で10分間加熱して、大きなDNAペレットを完全に溶解します。
加熱後、これらのチューブを3、400倍Gで1分間遠心分離し、蓋から凝縮液滴を回収する。濃度を測定し、分光光度計を用いて260/280比を求めた。良質のDNAの比率は、一般的に1.8から2の間です。
調製したサンプルを室温で600倍Gで1分間遠心分離した後、マイナス80°Cで24時間凍結します。次に、1マイクロリットルあたり1〜50ナノグラムの濃度の20マイクロリットルのサンプルを、シーケンシングのためにアルゴンヌ国立研究所に送ります。受容体CX3CR1を欠くマウス系統は、野生型MRL/LPRと比較して異なる腸内細菌叢組成を有し、MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFPマウスは、特定の属において有意差を示し、プロテオバクテリア門におけるもののような潜在的に病原性細菌に関連する。
サンプルの汚染に注意してください。それは無菌である必要があります。また、上清を新しいチューブに移す際にも、正確にピペッティングすることが重要です。
この方法は、PCR、制限酵素消化、ゲノムライブラリ構築などの分子解析に適しています。狼瘡では、腸内細菌叢と狼瘡の進行との間に強い関係があることが証明されました。
