تقنية الوضوح التي تم وصفها لأول مرة في عام 2013 هي تقنية إزالة الأنسجة التي تمكن من أخذ عينات من كميات أكبر من الخلايا والأوعية الدموية ، لذلك حتى البروتينات مثل دقة الخلية الواحدة في شرائح الدماغ السميكة. تمكن هذه التقنية من دراسة الهياكل المجهرية السليمة عن طريق جعل الدماغ بأكمله شفافا. هذا البروتوكول عبارة عن شريحة بسيطة وخط أنابيب مباشر لتنظيف الأنسجة.
يمكن استخدام هذه التقنية لتطهير الأنسجة في أنظمة أخرى بالإضافة إلى أنسجة المخ. للبدء ، قم بإغلاق الأنبوب والغطاء باستخدام parafilm وثقب ثقبين في الغطاء. ثم انقل غاز النيتروجين من الخزان باستخدام أنبوب مرن بقطر داخلي يبلغ خمسة ملليمترات وإبرة قياس 19 متصلة في نهايته.
ابدأ في إزالة الغاز عن طريق توصيل الأنبوب بالأنبوب والسماح بتبادل الغاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. افصل الأنبوب وأغلق الثقوب على الفور باستخدام طين النمذجة. ثم انقل الأنابيب المختومة بالديغا إلى حمام 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ونصف الساعة لبلمرة محلول الهيدروجيل.
أخرج الدماغ من الأنبوب. باستخدام مناديل المختبر، قم بإزالة الهيدروجيل المبلمر حول الدماغ لضمان عدم بقاء أي جل متبقي ملتصقا بسطح الدماغ. قسم الدماغ إلى شرائح سميكة تحتوي على جميع مجالات الاهتمام.
ضع الشرائح في محلول المقاصة الأول واحتضنها عند 37 درجة مئوية مع الدوران عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. في غضون ذلك ، قم بإعداد أنبوب مثقب لوضع الدماغ. ضع الأنبوب المثقب في كوب مملوء بمحلول إزالة ثان على جهاز تحريك.
ثم ضع الدماغ في الكأس وختمه بورق الألومنيوم لمنع التبييض. بعد أن يصبح النسيج شفافا ، انقل الدماغ إلى PBST في حضانة عند 37 درجة مئوية مع دوران عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. استبدل المحلول ب PBST طازج واستمر في الحضانة لمدة 24 ساعة أخرى.
ثم انقل الدماغ إلى PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الدماغ من PBS ونقله إلى محلول مطابقة معامل الانكسار. احتضان الدماغ عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
أولا، ضع العينة في منتصف الشريحة. باستخدام الغراء الساخن ، قم بإنشاء جدران على حواف الشريحة ، تقريبا مثل الأنسجة. تأكد من ترك فجوة صغيرة في أحد الزوايا.
عندما تقترب طبقة الغراء الساخن من ارتفاع شريحة الدماغ ، ضع قطرة إلى قطرتين من محلول مطابقة معامل الانكسار على العينة لترطيب السطح العلوي ومنع تكوين الفقاعة. بينما لا يزال الغراء الساخن سائلا ، أغلق الجزء العلوي بزلة غطاء ، وضعه بالتساوي قدر الإمكان ثم املأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار. أغلق الفجوة بالغراء الساخن.
إذا امتدت جدران الغراء الساخن خارج حدود الشريحة ، فقم بقطع الحواف الممتدة. إذا تم استخدام هدف غمر الزيت للتصوير ، فأضف من اثنين إلى ثلاثة ملليمترات أخرى من الغراء إلى الجدران فوق الغطاء للاحتفاظ بمحلول الغمر. بعد هذا البروتوكول ، سيتم مسح أنسجة المخ.
تم إعداد شرائح دماغية واضحة باستخدام هذا البروتوكول لتصور مجموعات من الخلايا النجمية والخلايا العصبية في منطقة CA1 من الحصين الفأر. عبرت جميع الخلايا النجمية عن tdTomato وعبرت الخلايا العصبية المثيرة عن H2B-GFP في نواتها. كانت الغرفة المعدة للأنسجة المصفاة مثالية للتصوير تحت فوتون اثنين أو مجهر بؤري.
باستخدام مجهرين فوتونيين ، تم رصد أكثر من 300 خلية نجمية في قسم واضح من منطقة CA1 من الحصين الفأر. كانت الخلايا النجمية الحصين في الخلايا الحمراء والهرمية ، والسوماتا باللون الأخضر مرئية وسميكة وشفافة تمثل القرب المكاني بين هذين النوعين من الخلايا. باستخدام المجهر البؤري بالليزر الماسح ، تم تتبع الحزم المحورية من الخلايا العصبية المثيرة عبر نصف الكرة الأرضية بأكمله.
تم تتبع الحزم الخضراء من الحصين الظهري نحو الأجسام الثديية الفائقة. تم تتبع الحزم الحمراء من أجسام الثدييات نحو أصلها في الحصين تنفيس. أثرت العوامل ، مثل درجة الحرارة والتركيزات ووقت الحضانة على نتيجة إجراء الوضوح.
لذلك ، فإن الدقة في كل خطوة من خطوات البروتوكول أمر حيوي لنجاح تحقيق أنسجة واضحة. باستخدام هذه التقنية ، نقيس المسافات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية في العديد من هياكل الدماغ. سمح هذا البروتوكول بتحليل اثنين إلى ثلاثة من الخلايا ذات الحجم أكثر مما كان عليه في الدراسات السابقة.
