تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na⁺ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا

يسلط هذا البروتوكول الضوء على دور الصوديوم كرسول ثان ويظهر أيضا وجود برك يوبيكوينول متباينة جزئيا. توضح هذه التقنية نهجا بسيطا للغاية لدراسة برك يوبيكوينول التي تتطلب نماذج خلايا محددة للغاية. يمكن استخدام هذا النهج لدراسة نقل الإلكترون في الأغشية الأخرى ، وخاصة الإنزيمات داخل قطرات الدهون.

قسم العينات إلى أربع عينات فرعية سعة كل منها 20 ميكروغرام وقم بتصنيفها من A إلى D.Split العينات A و B إلى عينتين فرعيتين سعة كل منهما 10 ميكروغرام وقم بتصنيفها على أنها A1 و A2 و B1 و B2. قم بإعداد المخزن المؤقت C1/C2 كما هو موضح في بروتوكول النص وقم بتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية. في كوفيت واحد ملليلتر ، أضف كل عينة من العينات الفرعية إلى 30 ميكرولتر من السيتوكروم c و 10 ميكرولترات من المالونات. أضف المخزن المؤقت C1 / C2 لرفع مستوى الصوت إلى 980 ميكرولتر في الكوفيت A1 و B1 و 979 ميكرولتر في A2 و B2. أضف 10 ميكرولترات من كلوريد البوتاسيوم المولي الواحد في الكوفيت A1 و A2 و 10 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم المولي الواحد في B1 و B2. أضف ميكرولتر واحد من روتينون مللي مولا واحد إلى الكوفيت A2 و B2. قبل القياس مباشرة ، أضف 10 ميكرولترات من NADH 10 ملليمولار في جميع الكفيتات.

اقلب الكوفيت ثلاث مرات وضعه في مقياس الطيف الضوئي. البرنامج المرفق ، انقر فوق قياس ثم المعلمات ، ثم انتقل إلى عام واضبط معلمات القياس على الطول الموجي البالغ 550 نانومتر والوقت في أربع دقائق من القراءة. انقر فوق موافق وابدأ لبدء التجربة.

في نهاية القياس، احفظ المنحدر الذي يتألف من الزيادة الخطية في الامتصاص بالنقر فوق ملف وحفظ As.Split العينتين C وD إلى عينتين فرعيتين سعة كل منهما 10 ميكروغرامات وتصنيفهما على أنهما C1 وC2 وD1 وD2. امزج كل عينة من العينات الفرعية في كوفيت سعة ملليلتر واحد مع 30 ميكرولتر من السيتوكروم c وميكرولتر واحد من الروتينون. أضف المخزن المؤقت C1 / C2 المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية لرفع الحجم إلى 980 ميكرولتر في cuvettes C1 و D1 و 970 ميكرولتر في C2 و D2. أضف 10 ميكرولترات من كلوريد البوتاسيوم المولي الواحد في الكوفيت C1 و C2 و 10 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المولي الواحد في D1 و D2. أضف ميكرولتر واحد من مضاد المايسينات A بملليمولار واحد إلى الكوفيتين C2 و D2 قبل القياس مباشرة و 10 ميكرولترات من سكسينات مولار واحد في جميع الكفيتات. اقلب الكوفيت ثلاث مرات وضعه في مقياس الطيف الضوئي.

قم بإجراء القياس وحفظ المنحدر الذي يضم الزيادة الخطية للامتصاص في نهاية القياس. تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة تأثير أيونات الصوديوم على تقليل السيتوكروم c بواسطة أغشية الميتوكوندريا على NADH أو إضافة السكسينات. تم تصحيح آثار الامتصاص المتولدة عند 550 نانومتر للعينتين A و B لتثبيطها المقابل.

أظهرت هذه الآثار منحدرا مشابها ، مما يشير إلى نشاط مماثل ل NADH-cytochrome c oxidoreductase. ومع ذلك، كانت آثار العينتين C و D مختلفة، مما يدل على أن نشاط أوكسيدوريدوكتاز السكسينات والسيتوكروم c للعينة C أعلى من نشاط D.In العينة من أجل تطبيع مقدار التغيير الذي تم قياسه باستخدام هذه التقنية، ويمكن إجراء طرق أخرى بشكل أكبر، مثل النشاط المعقد I المعزول أو المعقد II أو المعقد III. باستخدام هذه التقنية ، نستكشف الإعدادات الفسيولوجية التي قد يشارك فيها الصوديوم كرسول ثان.