La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na⁺ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati

Questo protocollo evidenzia il ruolo del sodio come secondo messaggero e mostra anche l'esistenza di pool di ubichinolo parzialmente differenziati. Questa tecnica dimostra un approccio estremamente semplice per lo studio delle piscine di ubichinolo che altrimenti richiede modelli cellulari molto specifici. Questo approccio può essere utilizzato per lo studio del trasferimento di elettroni in altre membrane, in particolare di enzimi all'interno di gocce lipidiche.

Dividere i campioni in quattro sottocampioni di 20 microgrammi ciascuno ed etichettarli da A a D.Dividere i campioni A e B in due sottocampioni di 10 microgrammi ciascuno ed etichettarli come A1, A2, B1 e B2. Preparare il buffer C1/C2 come descritto nel protocollo di testo e preriscaldare a 37 gradi Celsius. In una cuvetta da un millilitro, aggiungere ciascuno dei sottocampioni a 30 microlitri di citocromo c e 10 microlitri di malonato. Aggiungere il buffer C1/C2 per portare il volume a 980 microlitri nelle cuvette A1 e B1 e 979 microlitri in A2 e B2. Aggiungere 10 microlitri di cloruro di potassio monofusolare nelle cuvette A1 e A2 e 10 microlitri di cloruro di sodio monofusolare in B1 e B2. Aggiungere un microlitro di rotenone monomillolare nelle cuvette A2 e B2. Subito prima della misurazione, aggiungere 10 microlitri di NADH 10 millimolare in tutte le cuvette.

Capovolgere la cuvetta tre volte e posizionarla nello spettrofotometro. Al software allegato, clicca su Misura quindi su Parametri, quindi vai su Generale e imposta i parametri di misura a lunghezza d'onda di 550 nanometri e tempo a quattro minuti di lettura. Fare clic su OK e Start per iniziare l'esperimento.

Al termine della misurazione, salvare la pendenza che comprende l'aumento lineare dell'assorbanza facendo clic su File e Salva con nome.Dividere i campioni C e D in due sottocampioni di 10 microgrammi ciascuno ed etichettarli come C1, C2, D1 e D2. Mescolare ciascuno dei sottocampioni in una cuvetta da un millilitro con 30 microlitri di citocromo c e un microlitro di rotenone. Aggiungere il buffer C1/C2 preriscaldato a 37 gradi Celsius per portare il volume a 980 microlitri nelle cuvette C1 e D1 e 970 microlitri in C2 e D2. Aggiungere 10 microlitri di cloruro di potassio monofusolare nelle cuvette C1 e C2 e 10 microlitri di cloruro di sodio monofusolare in D1 e D2. Aggiungere un microlitro di antimicina A da un millimolare nelle cuvette C2 e D2 subito prima della misurazione e 10 microlitri di succinato monomastre in tutte le cuvette. Capovolgere la cuvetta tre volte e posizionarla nello spettrofotometro.

Eseguire la misurazione e salvare la pendenza che comprende l'aumento lineare dell'assorbanza alla fine della misurazione. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'effetto degli ioni sodio sulla riduzione del citocromo c da parte delle membrane mitocondriali su NADH o aggiunta di succinato. Le tracce di assorbanza generate a 550 nanometri per i campioni A e B sono state corrette per la loro corrispondente inibizione.

Queste tracce hanno mostrato una pendenza simile, indicando un'attività simile della NADH-citocromo c ossidoreduttasi. Tuttavia, le tracce per i campioni C e D erano diverse, dimostrando che l'attività della succinato-citocromo c ossidoreduttasi del campione C è superiore a quella del campione D.In fine di normalizzare la quantità di cambiamento misurata con questa tecnica, altri metodi possono essere ulteriormente eseguiti, come l'attività isolata del complesso I, il complesso II o il complesso III. Usando questa tecnica, stiamo esplorando le impostazioni fisiologiche in cui il sodio può essere coinvolto come secondo messaggero.