Ce protocole met en évidence le rôle du sodium en tant que deuxième messager et montre également l’existence de pools d’ubiquinol partiellement différenciés. Cette technique démontre une approche extrêmement simple pour l’étude des pools d’ubiquinol qui nécessite par ailleurs des modèles cellulaires très spécifiques. Cette approche peut être utilisée pour l’étude du transfert d’électrons dans d’autres membranes, en particulier des enzymes dans les gouttes lipidiques.
Divisez les échantillons en quatre sous-échantillons de 20 microgrammes chacun et étiquetez-les A à D.Divisez les échantillons A et B en deux sous-échantillons de 10 microgrammes chacun et étiquetez-les comme A1, A2, B1 et B2. Préparez le tampon C1/C2 comme décrit dans le protocole texte et préchauffez à 37 degrés Celsius. Dans une cuvette d’un millilitre, ajouter chacun des sous-échantillons à 30 microlitres de cytochrome c et 10 microlitres de malonate. Ajouter un tampon C1/C2 pour porter le volume à 980 microlitres dans les cuvettes A1 et B1 et 979 microlitres dans A2 et B2. Ajouter 10 microlitres de chlorure de potassium à une molaire dans les cuvettes A1 et A2 et 10 microlitres de chlorure de sodium à une molaire dans B1 et B2. Ajouter un microlitre de roténone millimolaire dans les cuvettes A2 et B2. Juste avant la mesure, ajoutez 10 microlitres de NADH de 10 millimolaires dans toutes les cuvettes.
Retournez la cuvette trois fois et placez-la dans le spectrophotomètre. Dans le logiciel ci-joint, cliquez sur Mesurer puis Paramètres, puis allez dans Général et réglez les paramètres de mesure à une longueur d’onde de 550 nanomètres et à quatre minutes de lecture. Cliquez sur OK et Démarrer pour commencer l’expérience.
À la fin de la mesure, enregistrez la pente comprenant l’augmentation linéaire de l’absorbance en cliquant sur Fichier et Enregistrer sous.Divisez les échantillons C et D en deux sous-échantillons de 10 microgrammes chacun et étiquetez-les comme C1, C2, D1 et D2. Mélanger chacun des sous-échantillons dans une cuvette d’un millilitre avec 30 microlitres de cytochrome c et un microlitre de roténone. Ajouter le tampon C1/C2 préchauffé à 37 degrés Celsius pour porter le volume à 980 microlitres dans les cuvettes C1 et D1 et 970 microlitres en C2 et D2. Ajouter 10 microlitres de chlorure de potassium à une molaire dans les cuvettes C1 et C2 et 10 microlitres de chlorure de sodium à une molaire dans D1 et D2. Ajouter un microlitre d’antimycine A millimolaire dans les cuvettes C2 et D2 juste avant la mesure et 10 microlitres de succinate d’une molaire dans toutes les cuvettes. Retournez la cuvette trois fois et placez-la dans le spectrophotomètre.
Effectuer la mesure et enregistrer la pente comprenant l’augmentation linéaire de l’absorbance à la fin de la mesure. Ce protocole a été utilisé pour étudier l’effet des ions sodium sur la réduction du cytochrome c par les membranes mitochondriales lors de l’ajout de NADH ou de succinate. Les traces d’absorbance générées à 550 nanomètres pour les échantillons A et B ont été corrigées pour leur inhibition correspondante.
Ces traces ont montré une pente similaire, indiquant une activité similaire de NADH-cytochrome c oxydoréductase. Cependant, les traces pour les échantillons C et D étaient différentes, montrant que l’activité succinate-cytochrome c oxydoréductase de l’échantillon C est supérieure à celle de l’échantillon D.In afin de normaliser la quantité de changement mesurée avec cette technique, d’autres méthodes peuvent être effectuées plus loin, telles que l’activité isolée du complexe I, le complexe II ou le complexe III. En utilisant cette technique, nous explorons les paramètres physiologiques dans lesquels le sodium peut être impliqué en tant que deuxième messager.
