Внутренняя чувствительность митохондриальной мембраны к Na⁺ раскрывает частично сегментированные функциональные пулы CoQ

Этот протокол подчеркивает роль натрия в качестве второго мессенджера, а также показывает существование частично дифференцированных пулов убихинола. Этот метод демонстрирует чрезвычайно простой подход к изучению пулов убихинолов, который в противном случае требует очень специфических моделей клеток. Этот подход может быть использован для изучения переноса электронов в других мембранах, особенно ферментов в липидных каплях.

Разделите образцы на четыре субобразца по 20 микрограммов каждый и пометьте их от A до D.Разделите образцы A и B на два субобразца по 10 микрограммов каждый и пометьте их как A1, A2, B1 и B2. Подготовьте буфер C1/C2, как описано в текстовом протоколе, и разогрейте до 37 градусов цельсия. В одном миллилитре кюветы добавьте каждый из субобразцов к 30 микролитрам цитохрома c и 10 микролитрам малоната. Добавьте буфер C1/C2, чтобы увеличить объем до 980 микролитров в кюветах A1 и B1 и 979 микролитров в A2 и B2. Добавьте 10 микролитров одномолярного хлорида калия в кюветах А1 и А2 и 10 микролитров одномолярного хлорида натрия в В1 и В2. Добавьте один микролитр одномимолярного ротенона в кюветы A2 и B2. Непосредственно перед измерением добавьте 10 микролитров 10-миллимолярного NADH во все кюветы.

Переверните кювету три раза и поместите ее в спектрофотометр. В прилагаемом программном обеспечении нажмите «Измерить, затем параметры», затем перейдите в «Общие» и установите параметры измерения на длине волны 550 нанометров и времени на четыре минуты чтения. Нажмите OK и Start, чтобы начать эксперимент.

В конце измерения сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения, щелкнув Файл и Сохранить как.Разделите образцы C и D на два субобразца по 10 микрограммов каждый и пометьте их как C1, C2, D1 и D2. Смешайте каждый из субобразцов в одномиллилитровой кювете с 30 микролитрами цитохрома c и одним микролитром ротенона. Добавьте буфер C1/C2, предварительно нагретый при 37 градусах Цельсия, чтобы увеличить объем до 980 микролитров в кюветах C1 и D1 и 970 микролитров в C2 и D2. Добавьте 10 микролитров одномолярного хлорида калия в кюветы C1 и C2 и 10 микролитров одномолярного хлорида натрия в D1 и D2. Добавьте один микролитр одномимолярного антимицина А в кюветы C2 и D2 непосредственно перед измерением и 10 микролитров одномолярного сукцината во все кюветы. Переверните кювету три раза и поместите ее в спектрофотометр.

Выполните измерение и сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения в конце измерения. Этот протокол использовался для изучения влияния ионов натрия на восстановление цитохрома c митохондриальными мембранами при добавлении NADH или сукцината. Следы поглощения, полученные на 550 нанометрах для образцов A и B, были скорректированы на их соответствующее ингибирование.

Эти следы показали аналогичный наклон, указывающий на аналогичную активность NADH-цитохрома c оксидоредуктазы. Однако следы для образцов C и D были разными, показывая, что сукцинат-цитохром c оксидоредуктазы активности образца C выше, чем у образца D.In чтобы нормализовать величину изменения, измеренного с помощью этого метода, другие методы могут быть дополнительно выполнены, такие как изолированная комплексная активность I, комплекс II или комплекс III. Используя эту технику, мы исследуем физиологические условия, в которых натрий может быть задействован в качестве второго мессенджера.