يصف هذا البروتوكول بالتفصيل ، التحضير الجراحي واستخدام نظام مستقر بالتفريغ لتصوير التصاق الكريات البيض الرئوية والتروية الشعرية في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصوير المستقر عالي الدقة داخل الجسم للرئة المتطابقة السليمة مع الحد الأدنى من الصدمات الجسدية. للبدء ، قم بإعداد نافذة التصوير عن طريق إدارة طبقة رقيقة من الشحوم الفراغية إلى أعلى الحلقة الخارجية مع تجنب تلوث قناة التفريغ.
ضع غطاء زجاجي نظيف بحجم 8 ملم على النافذة واضغط برفق لأسفل لإنشاء ختم. قم بتوصيل نافذة التصوير بمضخة تفريغ مزودة بمقياس ضغط رقمي وقادرة على توفير 50 إلى 60 ملم من الشفط الثابت للزئبق. مرر طول كابل الألياف البصرية من خلال قنية القصبة الهوائية قياس 20 وغمر الطرف في يدوكائين HCL.
بعد التخدير ، أدخل منظار الأذن المعدل ، بحيث تتناسب القواطع العلوية مع الفجوة في المنظار. اضبط المنظار وموضع اللسان حتى يصبح لسان المزمار والحبال الصوتية مرئيين بوضوح. أدخل كابل الألياف البصرية من خلال الفجوة الموجودة في المنظار واستخدم حركات دائرية صغيرة لتمرير الكابل بين الحبال الصوتية ، ثم استخدم كابل الألياف البصرية كدليل ، وحرك القنية بلطف في القصبة الهوائية لتنبيب الماوس.
بعد بدء التهوية بنسبة 1.5٪ isoflurane ، تأكد من عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس الدواسة. قم بتأمين القنية على الخطم بشريط طبي. استخدم شريط وضع العلامات لتثبيت المخلب الأمامي الأيمن على وسادة التدفئة في موضع الساعة التاسعة وتمديد المخلب الخلفي الأيسر بشكل سببي وتأمينه في وضع الساعة السادسة.
باستخدام شريط من القماش، قم بتمديد المخلب الأمامي الأيسر برفق إلى موضع الساعة 12 وقم بتثبيت الطرف الآخر من الشريط إلى أعلى منصة الفحص المجهري داخل الحيوية، ثم قم بتطبيق مسبار درجة حرارة المستقيم ومقياس التأكسج نبض المخلب لمراقبة العلامات الحيوية طوال التجربة. لإعداد الفأر للجراحة ، قم بتعقيم الصدر والبطن بمسح كحولي بنسبة 70٪ وتطبيق طبقة خفيفة من الزيت المعدني لترطيب الشعر على الجانب الأيسر من الماوس. قم بعمل شق صغير بالقرب من الجزء السفلي من القفص الصدري لفضح طبقة العضلات الأساسية ، ثم قم بتمديد الشق الأولي واستخدام تشريح حاد لفضح القفص الصدري.
باستخدام ملقط مرقئ ، أمسك الأنسجة الظهارية والدهنية التشريحية ووضعها بعيدا عن المنطقة الجراحية. لتسمية الكريات البيض وتدفق الدم بشكل فلوري ، قم بإعطاء 2.5 ملليلتر لكل كيلوغرام من Rhodamine 6G و FITC-albumin عبر الوريد الذيلي. باستخدام ملقط مسنن ، أمسك الضلع على الفور أدنى من موضع قاعدة الرئة في نهاية الإلهام.
اسحب الملقط قليلا لسحب الضلع بعيدا عن الرئة ثم قطع الضلع للحث على استرواح الصدر. قم بتمديد الشق أفقيا في كلا الاتجاهين ، مع الحرص على عدم لمس الرئة. أمسك الضلع الأعلى التالي بملقط حاد واتراجع قليلا للسماح للرئة بالسقوط بعيدا عن جدار الصدر.
إذا لم تنفصل الرئة ، فاضغط على جدار الصدر بخفة ضد الرئة لجعل الرئة تلتصق بغشاء الجنب الأساسي وبالتالي تسقط بسهولة أكبر. استمر في الشق الأصلي في النهاية حتى القص ومن الجمجمة حتى تنكشف قمة الرئة. استخدم أدوات تطبيق القطن والشاش لتخفيف أي نزيف ينشأ.
ارفع القفص الصدري لفضح الأوعية الدموية الوربية على الجانب الظهري من التجويف الصدري ، مع الحرص على عدم إتلاف الرئة ، وكي الوعاء الوربي الأكثر شأنا بالقرب من العمود الفقري ، ثم قطع الضلع المجاور. التحرك قحفيا ، وفي النهاية ، استخدم نمطا متكررا من الكي والقطع لاستئصال جزء واحد في سنتيمتر تقريبا من القفص الصدري. للتحضير للتصوير ، انقل منصة الفحص المجهري داخل الحيوية إلى مرحلة المجهر وضع نافذة التصوير مباشرة فوق الرئة المكشوفة.
استخدم المتلاعب الدقيق لخفض نافذة التصوير بعناية حتى تلتصق بسطح الرئة وتثبته. لتصور دوران الأوعية الدقيقة الرئوية ، استخدم مجهرا فلوريا واسع المجال مزودا بأهداف 20x ومجموعات مرشحات FITC و Rhodamine القياسية. استخدم كاميرا CCD بالأبيض والأسود لتسجيل مقاطع الفيديو بتباين مثالي.
باستخدام مجموعة مرشحات FITC ، حدد مكانا رئويا بناء على النمط المتقارب لتدفق الدم وسجل مقطع فيديو مدته 30 ثانية مع التركيز على المكان ، ثم كرر التسجيل في نفس مجال الرؤية باستخدام مجموعة مرشح Rhodamine لتصور الكريات البيض. لتحديد موقع الشريان الرئوي، استخدم مجموعة مرشح FITC لتحديد وعاء ذي نمط متباعد من تدفق الدم وتسجيل فيديو مدته 30 ثانية. كرر التسجيل في نفس مجال الرؤية باستخدام مجموعة مرشح Rhodamine لتصور الكريات البيض.
لتحديد المناطق الشعرية ذات الأهمية ، استخدم مجموعة مرشح FITC لتحديد منطقة من الحويصلات الهوائية والشعيرات الدموية التي لا تتقاطع مع أوعية أكبر وتسجيل فيديو مدته 30 ثانية. كرر التسجيل في نفس مجال الرؤية باستخدام مجموعة مرشح Rhodamine لتصور الكريات البيض. يصور هذا الفيديو تصوير FITC لتدفق الدم داخل مكان رئوي كما هو موضح في السهم الأخضر.
يسمح تصوير Rhodamine بتصور الكريات البيض في نفس المكان مع اثنين من الكريات البيض الملتصقة المشار إليها بالأسهم الحمراء. تم تطبيق هذه الطرق أيضا لتصور نفس الظواهر والشرايين الرئوية والمناطق الشعرية ذات الاهتمام. لإثبات التحديد الكمي لمعلمات الدورة الدموية الدقيقة ، عولجت الفئران باستخدام LPS داخل الأنف للحث على التهاب الرئة.
يظهر هنا الاتجار بالكريات البيض في الأماكن الرئوية مع مناطق محددة تمثل المناطق البطانية التي تم تحليلها في الفئران الساذجة والمعالجة ب LPS. تم زيادة التصاق الكريات البيض والدحرجة في الفئران المعالجة ب LPS. يظهر هنا الاتجار بالكريات البيض في الشرايين الرئوية مع مناطق محددة تمثل المناطق البطانية التي تم تحليلها في الفئران الساذجة والمعالجة ب LPS.
كان التصاق الكريات البيض أعلى في الفئران المعالجة ب LPS. يوضح هذا الشكل التصاق الكريات البيض داخل الشعيرات الدموية الرئوية في الفئران الساذجة والمعالجة ب LPS. وقد تبين أن التصاق الكريات البيض أعلى في الفئران المعالجة ب LPS مقابل الساذجة.
يوضح هذا الشكل تروية الشعيرات الدموية الرئوية في الفئران الساذجة والمعالجة ب LPS. وقد تبين أن كثافة الشعيرات الدموية الوظيفية أقل في الفئران المعالجة ب LPS مقابل الساذجة. هناك الكثير من الجوانب الصعبة لهذا البروتوكول.
يعد تحسين وضع الماوس على المنصة خطوة بسيطة يمكن أن تجعل الخطوات الجراحية والتصويرية أكثر قابلية للتكرار. هذا الإجراء قابل للتكيف مع مجموعة واسعة من معلمات الدراسة ونهج الفحص المجهري. لذلك ، ينبغي أن تسهل المزيد من الأبحاث حول دوران الأوعية الدقيقة الرئوية في كل من الحالات الصحية والمريضة.
