이 프로토콜은 생체내에서 폐 백혈구 부착 및 모세관 관류를 이미지화하기 위해, 외과적 준비 및 진공 안정화 시스템의 사용을 상세히 기술한다. 이 기술의 가장 큰 장점은 최소한의 물리적 외상으로 손상되지 않은 미러링 폐의 안정적인 고해상도 생체 내 이미징을 허용한다는 것입니다. 시작하려면, 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상부에 얇은 층의 진공 그리스를 투여하여 이미징 윈도우를 준비하십시오.
깨끗한 8mm 유리 커버 슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다. 이미징 창을 디지털 압력 게이지가 장착된 진공 펌프에 연결하고 50~60mm의 수은 정수 흡입을 제공할 수 있습니다. 길이 광섬유 케이블을 20 게이지 기관내 캐뉼라를 통과시키고 팁을 리도카인 HCL에 잠기십시오.
마취 후, 상부 절치가 검경의 틈새 내에 맞도록 수정 된 이토스코프를 삽입하십시오. epiglottis와 성대가 명확하게 보일 때까지 범위와 혀 위치를 조정하십시오. 검경의 틈새를 통해 광섬유 케이블을 삽입하고 작은 원형 움직임을 사용하여 성대 사이의 케이블을 통과 한 다음 광섬유 케이블을 가이드로 사용하여 캐뉼라를 기관으로 부드럽게 밀어 마우스를 삽관시킵니다.
1.5 % 이소플루란으로 환기를 시작한 후 페달 반사 검사를 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 캐뉼라를 의료용 테이프로 주둥이에 고정하십시오. 라벨링 테이프를 사용하여 오른쪽 앞발을 아홉 시 방향의 가열 패드에 고정하고 왼쪽 뒷발을 가성으로 뻗어 여섯 시 위치에 고정하십시오.
천 테이프를 사용하여 왼쪽 앞발을 12시 위치로 가볍게 펴고 테이프의 다른 쪽 끝을 생체 내 현미경 검사 플랫폼 상단에 고정시킨 다음 직장 온도 프로브와 발 맥박 산소 포화도 측정기를 적용하여 실험 전반에 걸쳐 활력 징후를 모니터링합니다. 수술을 위해 마우스를 준비하려면 70 % 알코올로 흉부와 복부를 살균하고 미네랄 오일의 라이트 코트를 적용하여 마우스 왼쪽의 머리카락을 적셔야합니다. 흉곽 케이지의 바닥 근처에 작은 절개를 만들어 기본 근육층을 노출 시킨 다음 초기 절개를 연장하고 무딘 해부를 사용하여 흉곽을 노출시킵니다.
지혈 포셉을 사용하여 해부 된 상피 및 지방 조직을 파악하고 수술 부위를 깨끗하게하십시오. 백혈구와 혈류를 형광 표지하려면 꼬리 정맥을 통해 로다민 6G 및 FITC 알부민의 킬로그램 당 2.5 밀리리터의 볼루스를 투여하십시오. 이빨이 달린 집게를 사용하여 갈비뼈를 최종 영감에서 폐 기저부의 위치보다 즉시 열등하게 잡으십시오.
포셉을 약간 후퇴시켜 갈비뼈를 폐에서 떼어낸 다음 갈비뼈를 잘라 기흉을 유발합니다. 절개를 양쪽 방향으로 옆으로 뻗어 폐에 닿지 않도록주의하십시오. 무딘 포셉으로 다음으로 높은 갈비뼈를 잡고 폐가 흉벽에서 떨어지도록 약간 후퇴하십시오.
폐가 분리되지 않으면 흉벽을 폐에 가볍게 눌러 폐가 하부 흉막에 달라 붙게하여 더 쉽게 떨어집니다. 결국 흉골까지 원래의 절개를 계속하고 폐의 정점이 노출 될 때까지 두개골로 계속하십시오. 면화 도포기와 거즈를 사용하여 발생하는 출혈을 감쇠시킵니다.
흉곽을 들어 흉강의 등쪽 측면에 늑간 혈관을 노출시키고, 폐를 손상시키지 않도록주의하고, 척추 기둥 근처에서 가장 열등한 늑간 혈관을 소작 한 다음 인접한 갈비뼈를 자릅니다. 두개골로 움직이고, 결국 반복되는 소작 및 절단 패턴을 사용하여 흉곽의 약 한 두 센티미터 부분을 소비합니다. 이미징을 준비하려면 생체 내 현미경 플랫폼을 현미경 단계로 옮기고 이미징 창을 노출 된 폐 바로 위에 놓습니다.
마이크로 조작기를 사용하여 이미징 창이 폐 표면에 부착되고 안정화될 때까지 조심스럽게 낮춥니다. 폐 미세 순환을 시각화하려면 20x 대물 및 표준 FITC 및 로다민 필터 세트가 장착 된 넓은 필드 형광 현미경을 사용하십시오. 흑백 CCD 카메라를 사용하여 최적의 대비로 비디오를 녹화하십시오.
FITC 필터 세트를 사용하여 혈류의 수렴 패턴을 기반으로 폐 장소를 식별하고 장소에 초점을 맞춘 30 초 비디오를 녹화 한 다음 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야각에서 녹화를 반복하십시오. 폐 동맥을 찾으려면 FITC 필터 세트를 사용하여 다양한 혈류 패턴이 있는 혈관을 식별하고 30초 분량의 비디오를 녹화합니다. 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야에서 기록을 반복하십시오.
관심 있는 모세관 영역을 찾으려면 FITC 필터 세트를 사용하여 더 큰 혈관에 의해 교차되지 않는 폐포 및 모세혈관의 영역을 식별하고 30초 비디오를 녹화합니다. 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야에서 기록을 반복하십시오. 이 비디오는 녹색 화살표로 표시된 대로 폐 부위 내의 혈류에 대한 FITC 이미징을 묘사합니다.
로다민 이미징은 빨간색 화살표로 표시된 두 개의 부착성 백혈구가있는 동일한 장소에서 백혈구를 시각화 할 수 있습니다. 이들 방법은 또한 동일한 현상과 폐동맥 및 모세혈관 관심 영역을 시각화하기 위해 적용되었다. 미세순환 파라미터의 정량화를 입증하기 위해, 마우스를 폐 염증을 유도하기 위해 비강내 LPS로 처리하였다.
폐 장소에서의 백혈구 밀매는 순진하고 LPS 처리된 마우스에서 분석된 내피 영역을 나타내는 윤곽이 그려진 영역과 함께 여기에 표시된다. 백혈구 부착 및 압연은 LPS 처리된 마우스에서 증가하였다. 폐동맥에서의 백혈구 밀매는 순진한 및 LPS 처리된 마우스에서 분석된 내피 영역을 나타내는 개략적인 영역과 함께 여기에 도시되어 있다.
백혈구 부착은 LPS 처리된 마우스에서 더 높았다. 이 그림은 순진하고 LPS 처리 된 마우스에서 폐 모세 혈관 내 백혈구 부착을 보여줍니다. 백혈구 부착은 LPS 처리된 마우스에서 순진한 마우스에 비해 더 높은 것으로 나타났다.
이 그림은 순진하고 LPS 처리 된 마우스에서 폐 모세 혈관의 관류를 보여줍니다. 기능적 모세관 밀도는 LPS 처리된 마우스에서 나이브 대비 더 낮은 것으로 나타났다. 이 프로토콜에는 많은 도전적인 측면이 있습니다.
플랫폼에서 마우스의 위치를 최적화하는 것은 수술 및 이미징 단계를 훨씬 더 재현 할 수있는 간단한 단계입니다. 이 절차는 광범위한 연구 매개 변수 및 현미경 접근법에 적용 할 수 있습니다. 따라서 건강한 상태와 병든 상태 모두에서 폐 미세 순환에 대한 추가 연구를 촉진해야합니다.
