يعد فحص 6-Plex ECL الجديد أول فحص متعدد الإرسال يتم التحقق من صحته ويتم تطبيقه الآن في التجارب السريرية لفحص السكان بشكل عام. فهو يجمع في وقت واحد بين ستة اختبارات للأجسام المضادة الذاتية مناسبة لفحص مرض السكري من النوع 1 ومرض الاضطرابات الهضمية و COVID-19 في عدد كبير من السكان. بالمقارنة مع فحص الأجسام المضادة الذاتية القياسي الحالي ، يمكن لهذه التقنية فحص الأجسام المضادة الذاتية المتعددة بكفاءة أكبر لأمراض المناعة الذاتية المتعددة في وقت واحد.
وسيجعل تأثير هذه التقنية الفحص على نطاق واسع أكثر جدوى وخاصا بالأمراض، مما يؤدي إلى التنبؤ المبكر بالأمراض للوقاية منها والتشخيص الأكثر دقة للعلاج. للبدء ، أضف أربعة ميكرولترات من بروتين مستضد البيوتينيل GAD65 و SARS-CoV-2 RBD و IA-2 و tTG و ZnT8 وبروتين مستضد البروأنسولين في أنبوب يحتوي على 156 ميكرولتر من 1٪ BSA واخلطه مع 240 ميكرولتر من الروابط المترافقة مع الستربتافيدين المقابلة ، 1 و 2 و 3 و 8 و 9 و 10. ثم ، احتضن الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
Aliquot 160 ميكرولتر من محلول التوقف في كل أنبوب واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الآن ، خذ 400 ميكرولتر من محلول الخليط من كل أنبوب وامزجها معا. أضف أربعة ميكرولترات من GAD65 و SARS-CoV-2 RBD و IA-2 و tTG و ZnT8 ومستضد البروأنسولين إلى الخليط.
ثم أضف 1.6 ملليلتر من محلول التوقف و 3.2 ملليلتر من PBS. امزج جميع المكونات جيدا. والآن ، حل المستضد جاهز للاستخدام في الفحص.
للحصول على لوحة PCR بسعة 96 بئرا ، قم بتركيب سبعة ميكرولترات من المصل لكل بئر وقم بتغطية اللوحة بفيلم مانع للتسرب. بعد ذلك ، قم بتسخين الأمصال عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على جهاز PCR وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة على اللوحة عند 100 مرة G لمدة دقيقة واحدة. أضف 63 ميكرولتر من محلول المستضد المحضر لكل بئر ، واخلطه مع المصل ، وقم بتغطية لوحة PCR بورق مانع للتسرب لتجنب الضوء.
رج الطبق على الخلاط بسرعة 450 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك ، احتضن اللوحة عند أربع درجات مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة. خذ صفيحة 6-Plex من الثلاجة ذات الأربع درجات مئوية ، مما يسمح للطبق بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
ثم ، أضف 150 ميكرولتر من 3٪ Blocker A إلى كل بئر من لوحة 6-Plex. غطي الطبق بورق القصدير لتجنب الضوء. ضع الطبق مرة أخرى في ثلاجة بأربع درجات مئوية واحتضنه طوال الليل.
في نهاية الحضانة ، بمجرد إزالة اللوحة من الثلاجة ، قم بإزالة كل المخزن المؤقت من اللوحة. ربت على الطبق على المناشف الورقية حتى يجف ، واغسله ثلاث مرات مع 150 ميكرولتر من مخزن الغسيل العازل لكل بئر في كل مرة. جفف اللوحة على منشفة ورقية و aliquot 30 ميكرولتر من مستضد المصل المحتضن من كل بئر من لوحة PCR المحتضنة بين عشية وضحاها إلى بئرين من لوحة 6-Plex.
قم بتغطية اللوحة بورق القصدير ، ثم ضع اللوحة على شاكر الطبق ورجها بسرعة 450 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بتفريغ المحلول الموجود في لوحة 6-Plex واغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام 150 ميكرولتر من مخزن غسيل كلوريد الصوديوم 0.4 M لكل بئر. بعد اكتمال الغسيل الثالث ، جفف اللوحة على المنشفة الورقية وأضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقراءة في كل بئر.
كانت مستويات ستة أجسام مضادة ذاتية ل GADA و IAA و IA-2A و ZnT8A و TGA و COVID-19A من فحص 6-Plex ECL مرتبطة ارتباطا جيدا بفحص ECL الفردي الستة المقابل لها ، واختبار الربط الراديوي القياسي الحالي. تم حساب قيم المؤشر لكل عينة لجميع الأجسام المضادة الستة مقابل الضوابط الإيجابية والسلبية المقابلة. ولوحظت قيمة مؤشر أكبر من القيمة القاطعة، مما يدل على نتيجة إيجابية.
اخترقت الأجسام المضادة الذاتية في المصل المستضد المسمى بالروثينيوم إلى المستضد البيوتينيل ، مما شكل معقدا مع رابط محدد لبناء منصة متعددة الإرسال. هذا التكتيك يجعل الفحص على نطاق واسع أكثر جدوى وأكثر كفاءة في عموم السكان لمرض السكري من النوع الأول والأمراض المصاحبة له، مما يؤدي إلى التنبؤ المبكر بالأمراض والوقاية منها.
