Este protocolo describe cómo detectar bacterias con impacto en la resistencia al estrés térmico oxidativo de C.elegans en dos cepas de C.elegans en 48 aislados bacterianos en paralelo. Este enfoque es versátil y escalable. Permite la detección rápida de múltiples condiciones con impacto en C.elegans contra la salud, que es aplicable al estudio de los mecanismos de salud y enfermedades.
Utilizando la resistencia al estrés como un proxy para la salud, esta tubería es fácilmente aplicable a la detección preclínica de medicamentos, antieméticos y probióticos en modelos mutantes, knockdown, transgénicos y de enfermedades con nematodos. La capacidad de probar muchas condiciones en paralelo permite el estudio de interacciones complejas involucradas y servir a procesos fisiológicos. Estos incluyen interacciones de microbios del huésped, trastornos metabólicos, manejo del estrés y envejecimiento.
Es fundamental evitar la contaminación en todas partes. No permita que los gusanos se queden sin comida y realice los pasos clave tan pronto como los gusanos alcancen la etapa requerida. Comience con la preparación de un cultivo concentrado de bacterias E. coli OP50 inoculando cuatro botellas de un litro de caldo de lisogenia con dos mililitros de cultivo iniciador OP50 cada una.
Luego coloque las botellas en una incubadora agitadora durante seis horas a 37 grados centígrados y 160 g, seguido de peletizar las bacterias a 3057 g y 20 grados centígrados durante 15 minutos. Después, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets con seis mililitros de OP50 medio. Recoger el cultivo concentrado en un tubo cónico estéril de 50 mililitros.
Inocular ocho placas NGM de seis centímetros por cepa con 100 microlitros de cultivo OP50 saturado cultivado durante la noche a 37 grados centígrados por placa. Luego mantenga las placas a 20 grados centígrados durante dos días antes de usarlas. Luego corte un trozo cuadrado de agar de 0,5 centímetros con gusanos de una placa NGM recientemente hambrienta usando un bisturí, y transfiéralo a cada una de las ocho placas NGM inoculadas de seis centímetros.
Incubar estas placas a 20 grados centígrados durante tres días. A continuación, vuelva a suspender los gusanos agregando hasta tres mililitros de tampón estéril M nueve a las placas NGM de seis centímetros con una pipeta P1000, y recoja la solución de gusano de las ocho placas por cepa en un solo tubo cónico de 15 mililitros. Luego centrifugar a 142 veces G durante dos minutos a cuatro grados centígrados, y retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta P5000 o una bomba de agua equipada con una pipeta o punta Pasteur estéril.
Después, agregue 10 mililitros de tampón estéril M nueve para lavar el pellet de lombriz. A continuación, retire el sobrenadante y transfiera los gusanos a una placa NGM inoculada OP50 de 15 centímetros suplementada con OP50 concentrada utilizando una pipeta. Cultive cada cepa de gusano en una placa NGM de 15 centímetros de diámetro durante tres o cuatro días a 15 grados centígrados realimentando a los gusanos con 0,5 mililitros de OP50 concentrado diariamente.
Después de recolectar y lavar un tampón M nueve, transfiera cada cultivo de cepa de gusano a más placas NGM y propague gusanos a 20 grados centígrados hasta que el 95% de la población sea adulta grávida. Luego blanquea los gusanos adultos grávidos siguiendo el método estándar de preparación de huevos, y transfiere los huevos a dos placas NGM de 15 centímetros sin semillas durante 24 horas a 15 grados centígrados para permitir que todas las larvas L one eclosionen y crezcan sincrónicamente en los pasos posteriores. Primero, recoja toda la masa bacteriana previamente cultivada en una placa de agar LB de seis centímetros y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros etiquetado que contenga un mililitro de tampón M nueve.
Luego haga un vórtice del tubo de microcentrífuga hasta que los gránulos bacterianos estén completamente resuspendidos. A continuación, gire hacia abajo a 9, 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y retire 700 microlitros de sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet bacteriano mediante vórtice.
A continuación, transfiera 200 microlitros de cada suspensión bacteriana a un solo pocillo de una placa vacía estéril de 96 pocillos. De esta placa, inocular ocho placas de agarosa de 96 pocillos NGM con 10 microlitros de solución bacteriana usando una pipeta multicanal, e incubar con la tapa puesta a 25 grados centígrados durante 24 horas. Después, selle la placa de suspensión de 96 pozos con una película de techo adhesiva limpia y guárdela a 15 grados centígrados durante un máximo de cinco días.
Para empezar, evalúe la etapa de desarrollo de una población de gusanos sincronizados observando las placas. Una vez que más del 90% de los gusanos hayan alcanzado L cuatro etapas, recolecte los gusanos en hasta 10 mililitros de solución estéril M nueve en tubos cónicos de 15 mililitros. A continuación, lave los gusanos extensamente durante cuatro veces girando hacia abajo a 142 veces G durante dos minutos a cuatro grados centígrados, mientras agrega 10 mililitros de M nueve estériles frescos entre cada lavado para deshacerse de la bacteria OP50.
Luego retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de gusano en 10 mililitros de M nueve. Transfiera 50 microlitros de solución de gusano a un tubo de unión superficial baja de 1,5 o dos mililitros que contenga 950 microlitros de M nueve. Después de mezclar suavemente el contenido del tubo para evitar la sedimentación de gusanos, use rápidamente una punta de pipeta humedecida de baja unión para transferir de tres a cuatro gotas separadas de 10 microlitros a un portaobjetos de vidrio o una placa NGM.
Bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 16X, cuente el número de gusanos y promedie los recuentos de tres a cuatro gotas para determinar el número de gusanos por microlitro en la solución de gusano. Ajuste la concentración de gusanos a 15 gusanos por microlitro en el tubo cónico de 15 mililitros. Luego transfiera ocho microlitros de solución de gusano a cada uno de los pocillos de las ocho placas de agarosa NGM de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal o una pipeta repetida.
Después de 36 horas, dispensar 30 microlitros de M nueve en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. A continuación, transfiera los gusanos a la placa de pocillos 384 de acuerdo con los diseños establecidos utilizando puntas de baja retención, asegurándose de que los lectores de placas estén configurados correctamente. Después, rellene las placas de 384 pocillos con más M nueve, apuntando a un volumen final de 60 microlitros por pozo agregando 40 microlitros de M nueve para el ensayo de estrés térmico y 34 microlitros de M nueve en seis microlitros de TBHP para el estrés oxidativo inducido por TBHP.
Luego comience el ensayo dentro de los dos minutos posteriores a la adición de TBHP. A continuación, cierre las placas con su tapa transparente y selle los bordes de las placas de pocillos 384 con cinta adhesiva, asegurándose de que la cinta no pase por encima de la tapa o debajo de la placa. A continuación, inserte la placa en el lector de placas.
Determine un valor de fluorescencia por debajo del cual un pico no sería significativamente diferente del ruido, y anote el punto de tiempo más temprano cuando las fluctuaciones de fluorescencia disminuyen antes de elevarse. A continuación, observe los puntos de tiempo entre los que se espera que caigan los valores de fluorescencia mínimos y máximos, ya que se utilizarán para el ajuste de la curva. Después, verifique si las amplitudes de los picos de fluorescencia varían significativamente entre los pozos.
Normalice los datos antes de un análisis adicional utilizando la fórmula como se describe en el manuscrito. En primer lugar, descargue LFASS desde GitHub, inicie MATLAB y navegue hasta la carpeta LFASS. Luego escriba y ejecute ajustar carpeta en la ventana de comandos, siguiendo las instrucciones en pantalla.
Después de escribir en la carpeta de ajuste, escriba el nombre de la carpeta de datos en la que se encuentra el archivo de Excel como Mis datos. A continuación, introduzca dos para el intervalo de tiempo entre mediciones sucesivas en el protocolo actual y escriba el valor del umbral de ruido. A continuación, asigne el umbral de tolerancia superior escribiendo 0.94 y el umbral de tolerancia inferior escribiendo 0.06 para restringir el ajuste sigmoide.
Establezca intervalos de tiempo para encontrar valores máximos y mínimos. Para inspeccionar visualmente los ajustes convergentes, escriba Y para sí o N para no para no para no mostrar curvas ajustadas y suaves cuando se le solicite. A continuación, proporcione límites de tiempo nuevos, inferiores y superiores para intentar el reacondicionamiento.
Si desea intentar el reacondicionamiento, escriba dos. Pero si desea aceptar el reacondicionamiento y pasar a la siguiente curva, escriba cero. Para elegir si analizar las curvas identificadas como ruido o reacondicionar curvas mal ajustadas, ya sea el tipo Y para aprobar y N rechazar.
Después de que se haya intentado o rechazado el reacondicionamiento para todas las curvas restantes, el programa finaliza. Recupere los archivos de resultados de la carpeta de resultados y guárdelos como punto XLSX para el análisis posterior. Se realizaron ensayos de resistencia al calor y al estrés oxidativo en Bristol N, dos gusanos de tipo salvaje, que se alimentaron con aislados bacterianos MYB11 o MYB115 o bacterias de control E coli OP50.
Después de 36 horas, las poblaciones adultas de gusanos de tipo salvaje fueron expuestas a 42 grados centígrados de estrés térmico y 7% de estrés oxidativo inducido por TBHP. La mediana del tiempo de muerte varió entre 40 y 130 minutos para el ensayo de estrés térmico, y entre 90 y 240 minutos para el ensayo de estrés oxidativo. Para asegurarse de que los gusanos crecen en el paso 2.5, y el paso 2.1 puede tardar hasta dos horas, dibuje un diseño de placa para preparar gusanos de 96 pocillos a 284 placas de pocillos en el paso 4.6.
Los pasos se pueden agregar o sustituir. Por ejemplo, las pruebas de ARN de todo el genoma del huésped o las pruebas genéticas bacterianas se pueden realizar sustituyendo aislados de bacterias intestinales por clones de RNI o mutantes bacterianos, respectivamente. Por lo tanto, actualmente estamos utilizando este enfoque para identificar nuevos probióticos y descubrir redes reguladoras de genes involucradas en las microinteracciones del huésped en el contexto de las infecciones y el envejecimiento.
