Este protocolo descreve como rastrear bactérias com impacto na resistência ao estresse térmico oxidativo de C.elegans em duas cepas de C.elegans em 48 isolados bacterianos em paralelo. Essa abordagem é versátil e escalável. Proporciona um rastreio rápido de múltiplas condições com impacto nos C.elegans contra a saúde, o que é aplicável ao estudo dos mecanismos de saúde e doenças.
Usando a resistência ao estresse como um proxy para a saúde, esse pipeline é prontamente aplicável à triagem pré-clínica de drogas, antieméticos e probióticos em modelos mutantes, knockdown, transgênicos e de doenças de nematoides. A capacidade de testar muitas condições em paralelo permite o estudo de interações complexas envolvidas e serve processos fisiológicos. Estes incluem interações de micróbios hospedeiros, distúrbios metabólicos, manuseio de estresse e envelhecimento.
É fundamental evitar a contaminação por toda parte. Não permita que os vermes fiquem sem comida e execute as principais etapas assim que os vermes atingirem o estágio necessário. Comece com a preparação de uma cultura concentrada de bactérias E.coli OP50 inoculando quatro frascos de um litro de caldo de lisogenia com dois mililitros de cultura inicial OP50 cada.
Em seguida, coloque as garrafas em uma incubadora agitada por seis horas a 37 graus Celsius e 160 G, seguido de peletização das bactérias a 3057 G e 20 graus Celsius por 15 minutos. Depois, descarte o sobrenadante e ressuscite os pellets com seis mililitros de meio OP50. Colete a cultura concentrada em um tubo cônico estéril de 50 mililitros.
Inocular oito placas de NGM de seis centímetros por cepa com 100 microlitros de cultura OP50 saturada cultivada durante a noite a 37 graus Celsius por placa. Em seguida, mantenha as placas a 20 graus Celsius por dois dias antes do uso. Em seguida, corte um pedaço de ágar quadrado de 0,5 centímetros com vermes de uma placa NGM recentemente faminta usando um bisturi e transfira para cada uma das oito placas NGM de seis centímetros inoculadas.
Incube essas placas a 20 graus Celsius por três dias. Em seguida, ressuspeite os vermes adicionando até três mililitros de tampão M nine estéril às placas NGM de seis centímetros usando uma pipeta P1000 e colete a solução de minhoca de todas as oito placas por cepa em um único tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar a 142 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius, e cuidadosamente remover o sobrenadante usando uma pipeta P5000 ou uma bomba de água equipada com uma pipeta ou ponta Pasteur estéril.
Depois, adicione 10 mililitros de tampão M nine estéril para lavar o pellet de minhoca. Em seguida, remova o sobrenadante e transfira os vermes para uma placa de NGM inoculada OP50 de 15 centímetros suplementada com OP50 concentrado usando uma pipeta. Cultive cada cepa de verme em uma placa NGM de 15 centímetros de diâmetro por três a quatro dias a 15 graus Celsius, realimentando os vermes com 0,5 mililitros de OP50 concentrado diariamente.
Depois de coletar e lavar um tampão M nine, transfira cada cultura de cepa de verme para mais placas de NGM e propague vermes a 20 graus Celsius até que 95% da população seja adulta gravídica. Em seguida, branqueie os vermes adultos gravídicos seguindo o método padrão de preparação de ovos e transfira os ovos para duas placas NGM de 15 centímetros não semeadas por 24 horas a 15 graus Celsius para permitir que todas as larvas L um eclodam e cresçam de forma síncrona nas etapas subsequentes. Primeiro, colete toda a massa bacteriana previamente cultivada em uma placa de ágar LB de seis centímetros e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro marcado contendo um mililitro de tampão M nove.
Em seguida, vortex o tubo de microcentrífuga até que os pellets bacterianos estejam totalmente suspensos novamente. Em seguida, gire para baixo a 9, 300 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente e remova 700 microlitros de sobrenadante. Novamente ressuspenda o pellet bacteriano por vórtice.
Em seguida, transfira 200 microlitros de cada suspensão bacteriana para um único poço de uma placa estéril vazia de 96 poços. A partir desta placa, inocular oito placas de agarose NGM de 96 poços com 10 microlitros de solução bacteriana usando uma pipeta multicanal e incubar com a tampa ligada a 25 graus Celsius por 24 horas. Depois, sele a placa de suspensão de 96 poços com filme adesivo limpo no teto e armazene-a a 15 graus Celsius por até cinco dias.
Para começar, avalie o estágio de desenvolvimento de uma população de vermes sincronizados observando as placas. Uma vez que mais de 90% dos vermes tenham atingido L quatro estágios, colete os vermes em até 10 mililitros de solução estéril de M nove em tubos cônicos de 15 mililitros. Em seguida, lave os vermes extensivamente por quatro vezes, girando para baixo a 142 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius, enquanto adiciona 10 mililitros de M nove estéreis frescos entre cada lavagem para se livrar da bactéria OP50.
Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet de minhoca em 10 mililitros de M nove. Transfira 50 microlitros de solução de minhoca para um tubo de ligação superficial baixa de 1,5 ou dois mililitros contendo 950 microlitros de M nove. Depois de misturar suavemente o conteúdo do tubo para evitar a sedimentação de vermes, use rapidamente uma ponta de pipeta de ligação baixa molhada para transferir três a quatro gotas separadas de 10 microlitros para uma lâmina de vidro ou uma placa NGM.
Sob um microscópio estéreo com ampliação de 16X, conte o número de vermes e calcule a média das contagens de três a quatro gotas para determinar o número de vermes por microlitro na solução de verme. Ajuste a concentração de minhocas para 15 minhocas por microlitro no tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, transfira oito microlitros de solução de minhoca para cada um dos poços das oito placas de agarose NGM de 96 poços usando uma pipeta multicanal ou pipeta de repetição.
Após 36 horas, dispense 30 microlitros de M nove em cada poço da placa de 96 poços. Em seguida, transfira os vermes para a placa de poço 384 de acordo com os layouts definidos usando pontas de baixa retenção, garantindo que os leitores de placa estejam configurados corretamente. Depois, complemente as placas de 384 poços com mais M nove, visando um volume final de 60 microlitros por poço, adicionando 40 microlitros de M nove para ensaio de estresse térmico e 34 microlitros de M nove em seis microlitros de TBHP para estresse oxidativo induzido por TBHP.
Em seguida, inicie o ensaio dentro de dois minutos após a adição de TBHP. Em seguida, feche as placas com a tampa transparente e sele as bordas das placas do poço 384 com fita adesiva, garantindo que a fita não passe por cima da tampa ou sob a placa. Em seguida, insira a placa no leitor de placas.
Determine um valor de fluorescência abaixo do qual um pico não seria significativamente diferente do ruído e observe o primeiro ponto de tempo em que as flutuações de fluorescência amortecem antes de subir. Em seguida, observe os pontos de tempo entre os quais se espera que os valores mínimos e máximos de fluorescência caiam, pois eles serão usados para o ajuste da curva. Depois, verifique se as amplitudes dos picos de fluorescência variam significativamente entre os poços.
Normalize os dados antes de uma análise mais aprofundada usando a fórmula descrita no manuscrito. Primeiro, baixe o LFASS do GitHub, inicie o MATLAB e navegue até a pasta LFASS. Em seguida, digite e execute a pasta fit na janela de comando, seguindo as instruções na tela.
Depois de digitar na pasta de ajuste, digite o nome da pasta de dados na qual o arquivo do Excel está localizado como Meus Dados. Em seguida, insira dois para o intervalo de tempo entre medições sucessivas no protocolo atual e digite o valor do limite de ruído. Em seguida, atribua o limite de tolerância superior digitando 0,94 e o limite de tolerância inferior digitando 0,06 para restringir o ajuste sigmoide.
Defina intervalos de tempo para localizar valores máximos e mínimos. Para inspecionar visualmente os ajustes convergentes, digite Y para sim ou N para não exibir curvas ajustadas e suaves quando solicitado. Em seguida, forneça limites de tempo novos, inferiores e superiores para tentar o reajuste.
Se você deseja tentar a reforma, digite dois. Mas se você deseja aceitar a reformulação e passar para a próxima curva, digite zero. Para escolher se deseja analisar curvas identificadas como ruído ou reformar curvas mal ajustadas, seja tipo Y para aprovar e N para rejeitar.
Após a tentativa ou recusa de reajuste para todas as curvas restantes, o programa termina. Recupere arquivos de resultados da pasta de resultados e salve como ponto XLSX para análise downstream. Ensaios de resistência ao calor e ao estresse oxidativo foram realizados em dois vermes do tipo selvagem Bristol N, que foram alimentados com isolados bacterianos MYB11 ou MYB115 ou bactérias controle E coli OP50.
Após 36 horas, as populações adultas de vermes do tipo selvagem foram expostas a estresse térmico de 42 graus Celsius e estresse oxidativo induzido por 7% TBHP. A mediana do tempo de óbito variou entre 40 a 130 minutos para o ensaio de estresse térmico e entre 90 a 240 minutos para o ensaio de estresse oxidativo. Para garantir que os vermes sejam cultivados na etapa 2.5, e a etapa 2.1 pode levar até duas horas, desenhe um layout de placa para preparar vermes de 96 poços a 284 placas de poço na etapa 4.6.
As etapas podem ser adicionadas ou substituídas. Por exemplo, telas de RNA amplas do genoma do hospedeiro ou telas genéticas bacterianas podem ser realizadas substituindo isolados de bactérias intestinais por clones de RNI ou mutantes bacterianos, respectivamente. Então, estamos atualmente usando essa abordagem para identificar novos probióticos e descobrir redes reguladoras de genes envolvidas nas microinterações do hospedeiro no contexto de infecções e envelhecimento.
