Dieses Protokoll beschreibt, wie in zwei C.elegans-Stämmen auf 48 Bakterienisolaten parallel nach Bakterien mit Auswirkungen auf die oxidative thermische Stressresistenz von C.elegans gescreent werden kann. Dieser Ansatz ist vielseitig und skalierbar. Es ermöglicht ein schnelles Screening mehrerer Erkrankungen mit Auswirkungen auf C.elegans gegen die Gesundheit, was auf die Untersuchung von Gesundheitsmechanismen und Krankheiten anwendbar ist.
Diese Pipeline nutzt Stressresistenz als Proxy für die Gesundheit und ist leicht auf das präklinische Screening von Medikamenten, Antiemetika und Probiotika auf Nematodenmutanten-, Knockdown-, transgenen und Krankheitsmodellen anwendbar. Die Fähigkeit, viele Bedingungen parallel zu testen, ermöglicht die Untersuchung komplexer Wechselwirkungen, die an physiologischen Prozessen beteiligt sind. Dazu gehören Wirtsmikrobeninteraktionen, Stoffwechselstörungen, Stressbewältigung und Alterung.
Es ist wichtig, eine Kontamination durchgehend zu vermeiden. Lassen Sie nicht zu, dass Würmern das Futter ausgeht, und führen Sie wichtige Schritte aus, sobald die Würmer das erforderliche Stadium erreicht haben. Beginnen Sie mit der Herstellung einer konzentrierten E.coli OP50-Bakterienkultur, indem Sie vier Ein-Liter-Flaschen Lysogenie-Brühe mit jeweils zwei Milliliter OP50-Starterkultur impfen.
Dann stellen Sie die Flaschen für sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 160 G in einen Schüttelinkubator, gefolgt von einer Pelletierung der Bakterien bei 3057 G und 20 Grad Celsius für 15 Minuten. Anschließend wird der Überstand verworfen und die Pellets mit sechs Milliliter OP50-Medium wieder suspendiert. Sammeln Sie die konzentrierte Kultur in einem sterilen 50-Milliliter-konischen Röhrchen.
Beimpfen Sie acht sechs Zentimeter große NGM-Platten pro Stamm mit 100 Mikrolitern gesättigter OP50-Kultur, die über Nacht bei 37 Grad Celsius pro Platte angebaut werden. Bewahren Sie die Platten dann vor Gebrauch zwei Tage lang bei 20 Grad Celsius auf. Dann schneiden Sie ein quadratisches Agarstück von 0,5 Zentimetern mit Würmern von einer kürzlich ausgehungerten NGM-Platte mit einem Skalpell ab und übertragen Sie es auf jede der acht geimpften sechs Zentimeter großen NGM-Platten.
Diese Platten drei Tage lang bei 20 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes suspendieren Sie die Würmer erneut, indem Sie bis zu drei Milliliter sterilen Mneun-Puffer mit einer P1000-Pipette zu den sechs Zentimeter langen NGM-Platten hinzufügen und die Schneckenlösung von allen acht Platten pro Stamm in einem einzigen 15-Milliliter-Konikuschen sammeln. Dann zentrifugieren Sie bei 142 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P5000-Pipette oder einer Wasserpumpe, die mit einer sterilen Pasteur-Pipette oder -Spitze ausgestattet ist.
Anschließend fügen Sie 10 Milliliter sterilen Mnine-Puffer hinzu, um das Schneckenpellet zu waschen. Als nächstes entfernen Sie den Überstand und übertragen die Würmer auf eine 15 Zentimeter große OP50-inokulierte NGM-Platte, die mit konzentriertem OP50 unter Verwendung einer Pipette ergänzt wurde. Züchten Sie jeden Wurmstamm auf einer NGM-Platte mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern für drei bis vier Tage bei 15 Grad Celsius, indem Sie die Würmer täglich mit 0,5 Milliliter konzentriertem OP50 erneut füttern.
Nach dem Sammeln und Waschen eines Mnine-Puffers übertragen Sie jede Wurmstammkultur auf mehr NGM-Platten und vermehren Sie die Würmer bei 20 Grad Celsius, bis 95% der Bevölkerung gravid Erwachsene sind. Dann bleichen Sie die graviden erwachsenen Würmer nach der Standard-Eizubereitungsmethode und übertragen Sie die Eier für 24 Stunden bei 15 Grad Celsius auf zwei ungesäte 15-Zentimeter-NGM-Platten, damit alle L-One-Larven in den folgenden Schritten synchron schlüpfen und wachsen können. Sammeln Sie zuerst die gesamte Bakterienmasse, die zuvor auf einer sechs Zentimeter großen LB-Agarplatte gewachsen war, und übertragen Sie sie in ein markiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter Mneun-Puffer enthält.
Anschließend wird das Mikrozentrifugenröhrchen durchgewirbelt, bis die Bakterienpellets wieder vollständig suspendiert sind. Als nächstes drehen Sie sich bei 9, 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur herunter und entfernen Sie 700 Mikroliter Überstand. Suspendieren Sie das Bakterienpellet erneut durch Wirbeln.
Anschließend werden 200 Mikroliter jeder Bakteriensuspension in eine einzige Vertiefung einer leeren sterilen 96-Well-Platte überführt. Von dieser Platte aus acht 96-Well-NGM-Agaroseplatten mit 10 Mikrolitern Bakterienlösung unter Verwendung einer Mehrkanalpipette beimpfen und mit dem Deckel bei 25 Grad Celsius 24 Stunden lang inkubieren. Anschließend versiegeln Sie die 96-Well-Aufhängungsplatte mit sauberer Deckenklebefolie und lagern Sie sie bis zu fünf Tage bei 15 Grad Celsius.
Um zu beginnen, beurteilen Sie das Entwicklungsstadium einer synchronisierten Wurmpopulation, indem Sie sich die Platten ansehen. Sobald mehr als 90% der Würmer die L-Vierstufe erreicht haben, sammeln Sie die Würmer in bis zu 10 Milliliter steriler Mnine-Lösung in 15-Milliliter-konischen Röhrchen. Als nächstes waschen Sie die Würmer viermal ausgiebig, indem Sie sie bei 142 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunterdrehen, während Sie zwischen jeder Wäsche 10 Milliliter frisches steriles M nine hinzufügen, um OP50-Bakterien loszuwerden.
Dann entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Schneckenpellet in 10 Milliliter M neun. 50 Mikroliter Schneckenlösung in ein 1,5 oder zwei Milliliter niedrigflächiges Binderohr mit 950 Mikrolitern Mnine überführen. Nach dem vorsichtigen Mischen des Röhrcheninhalts, um eine Wurmsedimentation zu vermeiden, verwenden Sie schnell eine benetzte Low-Bind-Pipettenspitze, um drei bis vier separate 10-Mikroliter-Tropfen auf einen Glasobjektträger oder eine NGM-Platte zu übertragen.
Zählen Sie unter einem Stereomikroskop mit 16-facher Vergrößerung die Anzahl der Würmer und mittelt die Anzahl von drei bis vier Tropfen, um die Anzahl der Würmer pro Mikroliter in der Wurmlösung zu bestimmen. Stellen Sie die Schneckenkonzentration im 15-Milliliter-Konikusröhrchen auf 15 Würmer pro Mikroliter ein. Dann werden acht Mikroliter Wurmlösung mit einer Mehrkanalpipette oder Wiederholungspipette in jede der Vertiefungen der acht 96 Well-NGM-Agaroseplatten überführt.
Nach 36 Stunden 30 Mikroliter Mnine in jede Vertiefung der 96-Well-Platte geben. Als nächstes übertragen Sie die Würmer auf die 384-Well-Platte gemäß den festgelegten Layouts mit niedrigen Retentionsspitzen, um sicherzustellen, dass die Plattenleser ordnungsgemäß eingerichtet sind. Anschließend füllen Sie die 384 Well-Platten mit mehr Mnine auf, wobei ein Endvolumen von 60 Mikrolitern pro Bohrloch angestrebt wird, indem 40 Mikroliter Mnine für die thermische Stressprobe und 34 Mikroliter Mnine in sechs Mikrolitern TBHP für TBHP-induzierten oxidativen Stress hinzugefügt werden.
Beginnen Sie dann mit dem Assay innerhalb von zwei Minuten nach Zugabe von TBHP. Als nächstes schließen Sie die Platten mit ihrem transparenten Deckel und versiegeln die Kanten der 384-Well-Platten mit Abdeckband, um sicherzustellen, dass das Band nicht über den Deckel oder unter die Platte geht. Legen Sie dann die Platte in den Plattenleser ein.
Bestimmen Sie einen Fluoreszenzwert, unterhalb dessen sich ein Peak nicht signifikant vom Rauschen unterscheidet, und notieren Sie den frühesten Zeitpunkt, zu dem Fluoreszenzschwankungen vor dem Anstieg dämpfen. Notieren Sie sich dann die Zeitpunkte, zwischen denen minimale und maximale Fluoreszenzwerte voraussichtlich fallen werden, da sie für die Kurvenanpassung verwendet werden. Überprüfen Sie anschließend, ob die Amplituden der Fluoreszenzpeaks zwischen den Vertiefungen signifikant variieren.
Normalisieren Sie die Daten vor der weiteren Analyse mit der Formel, wie im Manuskript beschrieben. Laden Sie zunächst LFASS von GitHub herunter, starten Sie MATLAB und navigieren Sie zum Ordner LFASS. Geben Sie dann fit folder im Befehlsfenster ein und führen Sie es aus, indem Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen.
Geben Sie nach der Eingabe in den Ordner fit den Namen Ihres Datenordners ein, in dem sich die Excel-Datei befindet, als Eigene Daten. Geben Sie dann zwei für das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Messungen im aktuellen Protokoll ein und geben Sie den Rauschschwellenwert ein. Weisen Sie als Nächstes den oberen Toleranzschwellenwert zu, indem Sie 0,94 eingeben, und den unteren Toleranzschwellenwert, indem Sie 0,06 eingeben, um die Sigmoidanpassung einzuschränken.
Legen Sie Zeitintervalle fest, um Maximal- und Minimalwerte zu finden. Um die konvergierenden Passungen visuell zu überprüfen, geben Sie Y für ja oder N für nein ein, um keine angepassten und glatten Kurven anzuzeigen, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Geben Sie als Nächstes neue, untere und obere Zeitgrenzen an, um eine Neuanpassung zu versuchen.
Wenn Sie die Umrüstung versuchen möchten, geben Sie zwei ein. Wenn Sie jedoch den Umbau akzeptieren und zur nächsten Kurve übergehen möchten, geben Sie Null ein. Um auszuwählen, ob Kurven, die als Rauschen identifiziert wurden, analysiert oder schlecht angepasste Kurven nachgerüstet werden sollen, geben Sie entweder Y ein, um zu genehmigen, und N, um abzulehnen.
Nachdem die Umrüstung für alle verbleibenden Kurven versucht oder abgelehnt wurde, endet das Programm. Rufen Sie die Ergebnisdateien aus dem Ergebnisordner ab und speichern Sie sie als Punkt XLSX für die nachgelagerte Analyse. Hitze- und oxidative Stressresistenztests wurden an Bristol N-zwei Wildtyp-Würmern durchgeführt, die entweder mit MYB11- oder MYB115-Bakterienisolaten oder E. coli OP50-Kontrollbakterien gefüttert wurden.
Nach 36 Stunden waren die erwachsenen Wildtyp-Wurmpopulationen 42 Grad Celsius thermischem Stress und 7% TBHP-induziertem oxidativem Stress ausgesetzt. Die mediane Todeszeit variierte zwischen 40 und 130 Minuten für den thermischen Stresstest und zwischen 90 und 240 Minuten für den oxidativen Stresstest. Um sicherzustellen, dass die Würmer in Schritt 2.5 gezüchtet werden und Schritt 2.1 bis zu zwei Stunden dauern kann, zeichnen Sie ein Plattenlayout, um Würmer von 96 Vertiefungsplatten bis 284 Vertiefungsplatten in Schritt 4.6 vorzubereiten.
Schritte können hinzugefügt oder ersetzt werden. Zum Beispiel können Wirtsgenom-weite RNA-Screens oder bakterielle genetische Screens durchgeführt werden, indem Darmbakterienisolate durch RNI-Klone bzw. bakterielle Mutanten ersetzt werden. Daher verwenden wir diesen Ansatz derzeit, um neue Probiotika zu identifizieren und genregulatorische Netzwerke aufzudecken, die an Mikrointeraktionen des Wirts im Zusammenhang mit Infektionen und Alterung beteiligt sind.
