يتيح هذا البروتوكول تقييم السلامة المشبكية في قوقعة الجربيل من جميع الأعمار. هذا مهم للبحث الأساسي في مشاكل السمع ، على وجه الخصوص ، بسبب الشيخوخة. البروتوكول سريع نسبيا وينتج بيانات كمية من عدة مواقع على طول القوقعة.
علاوة على ذلك ، فإنه يعالج مشكلة محددة تتمثل في شيخوخة الأنسجة باستخدام كوينشر التألق الذاتي. انحطاط نقاط الاشتباك العصبي هو أقرب علامة على فقدان الوظيفة في القوقعة. يعد قياسه كميا أداة مهمة في البحث نحو تطوير أدوات تشخيصية غير جراحية لاعتلال المشابك العصبي.
تشريح القوقعة الصناعية هو الجزء الأكثر أهمية الذي يحتاج إلى ممارسة ، لذلك من الأفضل البدء بالقوقعة غير التجريبية. ابدأ بإزالة الفطائر. قطع العظم بالمقص أو تكسير العظم بالملقط وإزالته بالملقط للوصول إلى القوقعة.
قم بإزالة القنوات العمودية والقنوات نصف الدائرية والقنوات نصف الدائرية. قم بإزالة العظم الذي يغطي قمة القوقعة بعناية وخدش عظم القوقعة الصناعية بالملقط لعمل ثقوب صغيرة في القمة وفي المنعطف القاعدي أو قم بكز الثقوب بعناية في كلا الموقعين. انقل الفقاعات على الفور إلى ما لا يقل عن 50 ملليلتر من المثبت البارد.
لقطع القوقعة إلى نصفين، ضع قطعة من شفرة الحلاقة لفترة أطول من الطول الملفوف للقوقعة في حامل شفرة. ثم ضع القوقعة في طبق بتري تحت مجهر ستيريو. قطع الأنسجة الزائدة باستخدام شفرة حلاقة أو بمقص دقيق.
امسك القوقعة في مكانها باستخدام ملقط ناعم وقطعها إلى نصفين على طول الموديولوس. تحضير محلول 5 ٪ من التبريد autofluororescence عن طريق مزجه مع 70 ٪ من الإيثانول. ضع الكوتشلي في هذا المحلول واحتضنه لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر متبوعا بغسل ثلاث مرات بملليلتر واحد من PBS لمدة خمس دقائق.
لتشريح القوقعة ، اجمع ملقطين دقيقين ، ملقطين فائقي الدقة ، فانا ، مقص زنبركي ، حامل شفرة ، شفرة حلاقة ، واملأ طبق بوليستيرول بتري وغطائه ب PBS. كسر القطع من شفرة الحلاقة للحصول على سطح قطع من اثنين إلى أربعة ملليمترات. قطع القوقعة إلى نصفين كما هو موضح في القسم لإعداد الأنسجة.
قم بإصلاح نصف القوقعة الصناعية بعناية باستخدام الملقط بحيث تكون الحافة المقطوعة متجهة لأعلى. استخدم مقص زنبركي ناعم لقطع عظم القوقعة فوق مهبط طائرات الهليكوبتر الذي يغطي القمة. ثم ، استخدم المقص لعزل المنعطف القمي عن طريق قطع modiolus والعصب السمعي ودهليز scala.
قم بإجراء قطعتين على كل جانب من عظم القوقعة الصناعية أعلاه ، أو إذا لم تكن هناك حاجة إلى الأوعية الدموية المخططة لمزيد من التقييم ، مباشرة من خلال الأوعية الدموية المخططة للمنعطف الأوسط. استخدم شفرة الحلاقة لفصل قطع القوقعة الصناعية. بدلا من ذلك ، قطع بين جهاز كورتي والأوعية الدموية ستريا.
اترك المخطط الوعائي متصلا بالرباط الحلزوني وقم بإزالة العظم المنزوع الكلس باستخدام الملقط. بعد ذلك ، انقل قطع القوقعة الصناعية إلى غطاء طبق بتري مملوء ب PBS. قم بإزالة الأنسجة الزائدة على جانبي العمود و modiolar بحيث تستلقي الحوامل بأكملها لاحقا على الشريحة بشكل مسطح قدر الإمكان.
يجب قطع قطع القوقعة الصناعية الكبيرة ، على وجه الخصوص ، تلك التي تنشأ من المنعطف القاعدي ، إلى قطعتين. قم بإزالة الغشاء التكتوري بعناية باستخدام ملقط فائق الدقة. ضع قطع القوقعة الصناعية على شريحة في قطرة من وسط التركيب ، مما يضمن أن جهاز كورتي مواجه لأعلى.
قم بتحويل قطعة القوقعة الصناعية إلى المستوى السهمي وابحث عن غزو الطرف الحلزوني على مقربة من خلايا الشعر الداخلية. يمكن رؤية هذا الغزو للطرف الحلزوني بشكل أكثر وضوحا في قطع القوقعة الصناعية الوسطى والقاعدية. انقل القوقعة بأكملها والأوعية الدموية المخططة بأكملها إلى شريحة المجهر عن طريق تكرار هذه الخطوات.
قم بتغطية الشريحة وأضف طلاء أظافر أسود حول الحواف لإغلاقها. تجف في الظلام وتخزنها عند أربع درجات مئوية. افتح نسخة من المكدسات غير المعقدة في برنامج ImageJ المحمل بالمكون الإضافي BioVoxxel.
قم بتقسيم القنوات بالنقر فوق صورة، ثم لون، ثم تقسيم القنوات. قم بدمجها بالنقر فوق صورة ، ثم لون ، ثم دمج القنوات لتعيين ألوان مختلفة. قم بتحويل الصورة إلى مكدس RGB بالنقر فوق صورة، ثم انتقل إلى اللون وانقر فوق Stack to RGB.
اضبط السطوع والتباين بالنقر فوق صورة وضبط ثم سطوع / تباين. استخدم إما شريط التمرير التلقائي أو شريط التمرير للتأكد من أن الهياكل قبل وبعد المشبكي وملصقات خلايا الشعر الداخلية متميزة عن الخلفية. قم بتسمية خمس خلايا شعرية داخلية باستخدام أداة النص بالنقر فوق الموقع المطلوب داخل المكدس.
بعد ذلك، انتقل إلى تحليل، ثم أدوات، وحدد مدير عائد الاستثمار. حدد تسميات خانة الاختيار لتسمية النقاط برقم. قم بتكبير خلية الشعر الداخلية المثيرة للاهتمام.
انقر بزر الماوس الأيمن على أداة النقطة لاختيار وضع النقاط المتعددة. قم بالتمرير عبر البعد Z وحساب نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية للشريط، والتي يتم تحديدها بواسطة شريط ما قبل المشبكي في تجاور مع رقعة الغلوتامات بعد المشبكي. بعد تحديد جميع هياكل الاهتمام ، انقر فوق إضافة مدير عائد الاستثمار ، ثم انقر فوق الاسم التعسفي واختر إعادة تسمية.
باستخدام أداة اليد ، اضبط الصورة لعرض خلية الشعر الداخلية التالية بالكامل. قم بالتغيير من أداة النقاط المتعددة إلى أداة النقطة لتجنب إضافة المزيد من النقاط إلى البيانات المخزنة مسبقا. انقر على بنية ذات أهمية داخل خلية الشعر الداخلية التالية وقم بالتغيير إلى أداة متعددة النقاط.
استمر في إضافة المشبك الشريطي الوظيفي في مدير عائد الاستثمار حتى يتم تقييم جميع خلايا الشعر الداخلية. انقر فوق مجموعة بيانات في مدير عائد الاستثمار ثم فوق قياس. انتظر حتى تظهر نافذة جديدة تسرد نقاط البيانات المقاسة وانقر فوق ملف وحفظ باسم لحفظ هذه القائمة كجدول بيانات.
احفظ الصورة عن طريق تنشيط إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار. انقر فوق Flatten لإضافة تسميات النقاط بشكل دائم إلى المكدس وانقر فوق الموافقة على الإغلاق عن طريق حفظ التغييرات. تظهر إسقاطات مكدس Z من قوقعة جربيل شاب يبلغ من العمر 10 أشهر أن خلايا الشعر الداخلية التي تحمل علامة الميوسين 7A الموضحة هنا بخطوط متقطعة بيضاء كانت في تناقض حاد مع الخلفية.
تم وضع علامة على الشرائط قبل المشبكي مع اثنين مضادين ل CtBP2 معروضين باللون الأخضر ، في حين تم وضع علامة على بقع الغلوتامات بعد المشبكي مع مضاد GluA2 موضح باللون الأحمر. تم علاج القوقعة من جربيل قديم يبلغ من العمر 38 شهرا باستخدام مبرد التألق الذاتي وأظهرت خلايا شعر داخلية متميزة ذات هياكل واضحة قبل وبعد المشبكية المرئية. لاختبار استقرار الوسم المناعي ، تم تصوير نفس القطعة من القوقعة من الجربيل الصغير بعد ثلاثة أشهر و 29 شهرا ونصف الشهر.
وعلى الرغم من انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء، كانت نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية متميزة وقابلة للقياس الكمي. حتى في حالة فشل القطع، قم بتركيب القطعة المتبقية من الأنسجة لتقدير طول القوقعة الصناعية بالكامل بدقة أكبر. البيانات من هذا البروتوكول ذات قيمة خاصة إذا سبقتها اختبارات السمع الكهروفسيولوجية أو النفسية الفيزيائية ، ثم ارتبطت بها بشكل فردي.
