Ce protocole permet d’évaluer l’intégrité synaptique dans la cochlée de la gerbille de tous âges. Ceci est important pour la recherche fondamentale sur les problèmes auditifs, en particulier ceux dus au vieillissement. Le protocole est relativement rapide et fournit des données quantitatives à plusieurs endroits le long de la cochlée.
En outre, il aborde un problème spécifique de vieillissement des tissus en utilisant un quencher d’autofluorescence. La dégénérescence des synapses est le premier signe de perte de fonction dans la cochlée. La quantification est un outil important dans la recherche visant à développer des outils de diagnostic non invasifs pour la synaptopathie.
La dissection cochléaire est la partie la plus cruciale qui nécessite de la pratique, il est donc préférable de commencer par des cochli non expérimentaux. Commencez par enlever les bulles. Coupez l’os avec des ciseaux ou craquez l’os avec une pince et retirez-le avec une pince pour atteindre la cochlée.
Enlevez les canaux malleus, incus et semi-circulaires. Retirez soigneusement l’os recouvrant l’apex de la cochlée et grattez l’os cochléaire avec une pince pour faire de petits trous à l’apex et dans le virage basal ou percez soigneusement des trous aux deux endroits. Transférez immédiatement les bulles dans au moins 50 millilitres de fixateur froid.
Pour couper le cochli en deux, placez un morceau de lame de rasoir plus long que la longueur enroulée de la cochlée dans un support de lame. Ensuite, placez la cochlée dans une boîte de Petri sous un stéréomicroscope. Coupez l’excès de tissu avec une lame de rasoir ou avec de fins ciseaux.
Maintenez la cochlée en place avec une pince fine et coupez-la en deux le long du modiolus. Préparez une solution à 5% du quencher d’autofluorescence en le mélangeant avec de l’éthanol à 70%. Placez le cochli dans cette solution et incubez-le pendant une minute à température ambiante sur un agitateur, puis lavez trois fois avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes.
Pour la dissection de la cochlée, collectez deux pinces fines, des pinces super fines, des vannas, des ciseaux à ressort, un porte-lame, une lame de rasoir et remplissez la boîte de Petri en polystyrol et son couvercle avec du PBS. Casser des morceaux de la lame de rasoir pour obtenir une surface de coupe de deux à quatre millimètres. Coupez la cochlée en deux comme indiqué dans la section pour la préparation des tissus.
Fixez soigneusement la moitié cochléaire avec la pince de manière à ce que le bord coupé soit tourné vers le haut. Utilisez de fins ciseaux à ressort pour couper l’os de la cochlée au-dessus de l’hélicotréma recouvrant l’apex. Ensuite, utilisez des ciseaux pour isoler le tour apical en coupant à travers le modiolus et le nerf auditif et scala vestibuli.
Faites deux coupures de chaque côté de l’os cochléaire ci-dessus, ou si la stria vascularis n’est pas nécessaire pour une évaluation plus approfondie, directement à travers la stria vascularis du virage moyen. Utilisez la lame de rasoir pour séparer les pièces cochléaires. Alternativement, couper entre l’organe de Corti et la stria vascularis.
Laissez la stria vascularis reliée au ligament spiralé et retirez l’os décalcifié à l’aide d’une pince. Ensuite, transférez les morceaux cochléaires dans un couvercle de boîte de Petri rempli de PBS. Enlevez l’excès de tissu sur le pilier et les côtés modiolaires de sorte que l’ensemble des supports repose plus tard sur la glissière aussi plat que possible.
Les gros morceaux cochléaires, en particulier ceux provenant du tour basal, doivent être coupés en deux morceaux. Retirez soigneusement la membrane tectoriale avec une pince ultra-fine. Placez les pièces cochléaires sur une glissière dans une goutte de support de montage, en veillant à ce que l’organe de Corti soit tourné vers le haut.
Déplacez la pièce cochléaire dans le plan sagittal et recherchez l’invagination du limbe spiralé à proximité des cellules ciliées internes. Cette invagination du limbe spiralé peut être vue plus clairement dans les pièces cochléaires moyennes et basales. Transférez toute la cochlée et toute la stria vascularis sur la lame du microscope en répétant ces étapes.
Couvrez la glissière et ajoutez du vernis à ongles noir sur les bords pour sceller. Sécher dans l’obscurité et les stocker à quatre degrés Celsius. Ouvrez une copie des piles déconvolved dans le logiciel ImageJ chargé avec le plugin BioVoxxel.
Divisez les couches en cliquant sur Image, puis sur Couleur, puis sur Fractionner les couches. Fusionnez-les en cliquant sur Image, puis sur Couleur, puis sur Fusionner les couches pour attribuer différentes couleurs. Convertissez l’image en pile RVB en cliquant sur Image, puis allez dans Couleur et cliquez sur Pile en RVB.
Ajustez la luminosité et le contraste en cliquant sur Image, Réglage, puis Luminosité/Contraste. Utilisez l’auto ou le curseur pour vous assurer que les structures pré-et post-synaptiques et les étiquettes internes des cellules ciliées sont distinctes de l’arrière-plan. Étiquetez cinq cellules ciliées internes avec l’outil texte en cliquant sur l’emplacement souhaité dans la pile.
Ensuite, accédez à Analyser, puis Outils, puis sélectionnez Gestionnaire de retour sur investissement. Cochez les étiquettes des cases à cocher pour étiqueter les points avec un numéro. Zoomez sur la cellule ciliée interne d’intérêt.
Faites un clic droit sur l’outil de pointage pour choisir le mode Multipoint. Faites défiler la dimension Z et comptez les synapses fonctionnelles du ruban, qui sont identifiées par un ruban pré-synaptique en juxtaposition à un patch de glutamate post-synaptique. Après avoir sélectionné toutes les structures d’intérêt, cliquez sur Ajouter le gestionnaire de retour sur investissement, puis cliquez sur le nom arbitraire et choisissez Renommer.
Avec l’outil manuel, ajustez l’image pour afficher complètement la cellule ciliée interne suivante. Passez de l’outil Multipoint à l’outil Point pour éviter d’ajouter plus de ponctuation aux données précédemment stockées. Cliquez sur une structure d’intérêt dans la cellule ciliée interne suivante et passez à l’outil Multipoint.
Continuez à ajouter la synapse du ruban fonctionnel dans le gestionnaire de retour sur investissement jusqu’à ce que toutes les cellules ciliées internes soient évaluées. Cliquez sur un ensemble de données dans le gestionnaire de retour sur investissement, puis sur Mesure. Attendez qu’une nouvelle fenêtre apparaisse qui répertorie les points de données mesurés et cliquez sur Fichier et Enregistrer sous pour enregistrer cette liste en tant que feuille de calcul.
Enregistrez l’image en activant Afficher tout dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Aplatir pour ajouter définitivement les étiquettes de points à la pile et cliquez sur Accepter pour fermer en enregistrant les modifications. Les projections de la pile Z de la cochlée d’une jeune gerbille âgée de 10 mois montrent que les cellules ciliées internes marquées à la myosine 7A soulignées ici par des lignes pointillées blanches contrastaient fortement avec l’arrière-plan.
Les rubans pré-synaptiques ont été étiquetés avec deux anti-CtBP2 en vert, tandis que les patchs de glutamate post-synaptiques ont été étiquetés avec anti-GluA2 en rouge. La cochlée d’une vieille gerbille âgée de 38 mois a été traitée avec le quencher d’autofluorescence et a montré des cellules ciliées internes distinctes avec des structures pré et post-synaptiques clairement visibles. Pour tester la stabilité de l’immunomarquage, le même morceau de cochlée de la jeune gerbille a été imagé après trois mois et 29 mois et demi.
Malgré le rapport signal/bruit réduit, les synapses fonctionnelles étaient distinctes et quantifiables. Même si une coupe échoue, montez le morceau de tissu restant pour estimer plus tard la longueur cochléaire complète avec le plus de précision. Les données de ce protocole sont particulièrement précieuses si elles sont précédées de tests auditifs électrophysiologiques ou psychophysiques, puis corrélées individuellement avec eux.
