Questo protocollo consente la valutazione dell'integrità sinaptica nella coclea del gerbillo di tutte le età. Questo è importante per la ricerca fondamentale sui problemi di udito, in particolare a causa dell'invecchiamento. Il protocollo è relativamente veloce e fornisce dati quantitativi da diverse posizioni lungo la coclea.
Inoltre, affronta un problema specifico dell'invecchiamento del tessuto utilizzando un quencher ad autofluorescenza. La degenerazione delle sinapsi è il primo segno di perdita di funzione nella coclea. Quantificarlo è uno strumento importante nella ricerca verso lo sviluppo di strumenti diagnostici non invasivi per la sinaptopatia.
La dissezione cocleare è la parte più cruciale che richiede pratica, quindi è meglio iniziare con cochli non sperimentali. Inizia rimuovendo le bolle. Tagliare l'osso con le forbici o rompere l'osso con una pinza e rimuoverlo con una pinza per raggiungere la coclea.
Rimuovere il malleus, l'incus e i canali semicircolari. Rimuovere con cura l'osso che copre l'apice della coclea e graffiare l'osso cocleare con una pinza per fare piccoli fori all'apice e nel giro basale o fare accuratamente fori in entrambe le posizioni. Trasferire immediatamente le bolle in almeno 50 millilitri di fissativo freddo.
Per tagliare i cochli a metà, posizionare un pezzo di lama di rasoio più lungo della lunghezza arrotolata della coclea in un supporto per lama. Quindi, posizionare la coclea in una capsula di Petri sotto uno stereomicroscopio. Tagliare via il tessuto in eccesso con una lama di rasoio o con forbici fini.
Tenere la coclea in posizione con una pinza fine e tagliarla a metà lungo il modiolo. Preparare una soluzione al 5% del quencher ad autofluorescenza mescolandola con etanolo al 70%. Posizionare i cochli in questa soluzione e incubarlo per un minuto a temperatura ambiente su uno shaker seguito da lavare tre volte con un millilitro di PBS per cinque minuti.
Per la dissezione della coclea, raccogliere due pinze fini, pinze super-fini, vannas, forbici a molla, un supporto per lame, una lama di rasoio e riempire la capsula di Petri in polistirolo e il suo coperchio con PBS. Rompere i pezzi dalla lama del rasoio per ottenere una superficie di taglio da due a quattro millimetri. Tagliare la coclea a metà come mostrato nella sezione per la preparazione dei tessuti.
Fissare con cura la metà cocleare con la pinza in modo tale che il bordo tagliato sia rivolto verso l'alto. Utilizzare forbici a molla fine per tagliare via l'osso della coclea sopra l'elicotrema che copre l'apice. Quindi, utilizzare le forbici per isolare il giro apicale tagliando il modiolo e il nervo uditivo e il vestibolo della scala.
Fare due tagli su ciascun lato dell'osso cocleare sopra, o se la stria vascolare non è necessaria per un'ulteriore valutazione, direttamente attraverso la stria vascolare del giro centrale. Usa la lama del rasoio per separare i pezzi cocleari. In alternativa, tagliare tra l'organo di Corti e la stria vascolare.
Lasciare la stria vascolare collegata al legamento a spirale e rimuovere l'osso decalcificato usando una pinza. Quindi, trasferire i pezzi cocleari in un coperchio della capsula di Petri riempito con PBS. Rimuovere il tessuto in eccesso sul pilastro e sui lati modiolari in modo tale che l'intero supporto si trovi successivamente sulla diapositiva il più piatto possibile.
I pezzi cocleari di grandi dimensioni, in particolare quelli provenienti dal giro basale, dovrebbero essere tagliati in due pezzi. Rimuovere con cura la membrana tectoriale con una pinza super-fine. Posizionare i pezzi cocleari su una diapositiva in una goccia di mezzo di montaggio, assicurandosi che l'organo di Corti sia rivolto verso l'alto.
Sposta il pezzo cocleare nel piano sagittale e cerca l'invaginazione del limbus a spirale in prossimità delle cellule ciliate interne. Questa invaginazione del limbus a spirale può essere vista più chiaramente nei pezzi cocleari centrali e basali. Trasferire l'intera coclea e l'intera stria vascolare sul vetrino del microscopio ripetendo questi passaggi.
Coprire scivolare la diapositiva e aggiungere smalto nero intorno ai bordi per sigillare. Asciugare al buio e conservarli a quattro gradi Celsius. Apri una copia degli stack deconvolti nel software ImageJ caricato con il plugin BioVoxxel.
Dividere i canali facendo clic su Immagine, quindi su Colore e quindi su Dividi canali. Uniscili facendo clic su Immagine, quindi su Colore e quindi su Unisci canali per assegnare colori diversi. Converti l'immagine in uno stack RGB facendo clic su Immagine, quindi vai su Colore e fai clic su Impila in RGB.
Regola la luminosità e il contrasto facendo clic su Immagine, Regola e quindi su Luminosità/Contrasto. Utilizzare l'auto o il dispositivo di scorrimento per garantire che le strutture pre e post-sinaptiche e le etichette interne delle cellule ciliate siano distinte dallo sfondo. Etichetta cinque celle ciliate interne con lo strumento testo facendo clic sulla posizione desiderata all'interno della pila.
Quindi, vai su Analizza, quindi su Strumenti e seleziona ROI Manager. Seleziona le etichette delle caselle di controllo per etichettare i punti con un numero. Ingrandisci la cellula ciliata interna di interesse.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento punto per scegliere la modalità multipunto. Scorrere la dimensione Z e contare le sinapsi funzionali del nastro, che sono identificate da un nastro pre-sinaptico in giustapposizione a un cerotto di glutammato post-sinaptico. Dopo aver selezionato tutte le strutture di interesse, fai clic su Aggiungi il ROI Manager, quindi fai clic sul nome arbitrario e scegli Rinomina.
Con lo strumento manuale, regola l'immagine per visualizzare completamente la cella ciliata interna successiva. Passare dallo strumento Multipunto allo strumento Punto per evitare di aggiungere ulteriori puncta ai dati memorizzati in precedenza. Fare clic su una struttura di interesse all'interno della cella ciliata interna successiva e passare allo strumento Multipunto.
Continuare ad aggiungere la sinapsi funzionale del nastro nel ROI Manager fino a quando tutte le cellule ciliate interne non vengono valutate. Fare clic su un set di dati nel ROI Manager e quindi su Misura. Attendi che appaia una nuova finestra che elenca i punti dati misurati e fai clic su File e Salva con nome per salvare questo elenco come foglio di calcolo.
Salva l'immagine attivando Mostra tutto nel ROI Manager. Fare clic su Appiattisci per aggiungere definitivamente le etichette dei punti allo stack e fare clic su Accetto per chiudere salvando le modifiche. Le proiezioni della pila Z dalla coclea di un giovane gerbillo di 10 mesi mostrano che le cellule ciliate interne marcate con miosina 7A delineate qui da linee tratteggiate bianche erano in netto contrasto con lo sfondo.
I nastri pre-sinaptici sono stati etichettati con anti-CtBP2 due mostrati in verde, mentre i cerotti di glutammato post-sinaptico sono stati etichettati con anti-GluA2 mostrato in rosso. La coclea di un vecchio gerbillo di 38 mesi è stata trattata con il quencher ad autofluorescenza e ha mostrato cellule ciliate interne distinte con strutture pre e post-sinaptiche chiaramente visibili. Per testare la stabilità dell'immunolabeling, lo stesso pezzo di coclea del giovane gerbillo è stato ripreso dopo tre mesi e 29 mesi e mezzo.
Nonostante il ridotto rapporto segnale-rumore, le sinapsi funzionali erano distinte e quantificabili. Anche se un taglio fallisce, montare il pezzo di tessuto rimanente per stimare successivamente l'intera lunghezza cocleare in modo più accurato. I dati di questo protocollo sono particolarmente preziosi se preceduti e quindi correlati individualmente con test dell'udito elettrofisiologici o psicofisici.
