Este protocolo permite a avaliação da integridade sináptica na cóclea do gerbil de todas as idades. Isso é importante para pesquisas fundamentais sobre problemas auditivos, em particular, devido ao envelhecimento. O protocolo é relativamente rápido e produz dados quantitativos de vários locais ao longo da cóclea.
Além disso, aborda um problema específico do envelhecimento do tecido usando uma saciador de autofluorescência. A degeneração das sinapses é o primeiro sinal de perda de função na cóclea. Quantificá-lo é uma ferramenta importante na pesquisa para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico não invasivas para a sinaptopatia.
A dissecção coclear é a parte mais crucial que precisa de prática, por isso é melhor começar com cochli não experimental. Comece removendo o bullae. Corte o osso com uma tesoura ou quebre o osso com fórceps e remova-o com fórceps para alcançar a cóclea.
Remova os canais malleus, incus e semicircular. Remova cuidadosamente o osso que cobre o ápice da cóclea e arranhe o osso coclear com fórceps para fazer pequenos orifícios no ápice e na curva basal ou cuidadosamente fazer buracos em ambos os locais. Transfira imediatamente o bullae para pelo menos 50 mililitros de fixação fria.
Para cortar o cochli ao meio, posicione um pedaço de lâmina de barbear por mais tempo do que o comprimento enrolado da cóclea em um suporte de lâmina. Em seguida, coloque a cóclea em uma placa de Petri sob um microscópio estéreo. Corte o excesso de tecido com uma lâmina de barbear ou com uma tesoura fina.
Segure a cóclea no lugar com fórceps finos e corte ao meio ao longo do modiolo. Prepare uma solução de 5% do quencher de autofluorescência misturando-o com 70% de etanol. Coloque o cochli nesta solução e incuba-o por um minuto à temperatura ambiente em um shaker seguido de lavagem três vezes com um mililitro de PBS por cinco minutos.
Para a dissecção da cóclea, colete duas fórceps finas, fórceps super finos, vannas, tesouras de mola, um porta-lâminas, uma lâmina de barbear, e encha a placa de Petri de polistyrol e sua tampa com PBS. Quebre peças da lâmina de barbear para obter uma superfície de corte de dois a quatro milímetros. Corte a cóclea ao meio, conforme mostrado na seção para preparação do tecido.
Fixar cuidadosamente a metade coclear com os fórceps de tal forma que a borda de corte esteja voltada para cima. Use uma tesoura de mola fina para cortar o osso da cóclea acima do helicotrema que cobre o ápice. Em seguida, use a tesoura para isolar a curva apical cortando através do mólico e nervo auditivo e scala vestibuli.
Faça dois cortes em cada lado do osso coclear acima, ou se a estria vascularis não for necessária para avaliação posterior, diretamente através da estria vascularis da curva média. Use a lâmina de barbear para separar as peças cocleares. Alternativamente, corte entre o órgão de Corti e a estria vascularis.
Deixe a estria vasculare conectada ao ligamento espiral e remova o osso descalcificado usando fórceps. Em seguida, transfira as peças cocleares em uma tampa de placa de Petri cheia de PBS. Remova o excesso de tecido no pilar e nos lados do modiolar de tal forma que todas as montagens mais tarde deitem-se na lâmina o mais plana possível.
Grandes peças cocleares, em particular, aquelas originárias da curva basal, devem ser cortadas em duas peças. Remova cuidadosamente a membrana tectorial com fórceps super finos. Coloque as peças cocleares sobre um slide em uma gota de meio de montagem, garantindo que o órgão de Corti se enlouqueça.
Desloque a peça coclear para o plano sagital e procure a invaginação do limbus espiral nas proximidades das células ciliares internas. Esta invaginação do limbus espiral pode ser vista mais claramente nas peças coclear médias e basais. Transfira toda a cóclea e toda a estria vascularis para o slide do microscópio repetindo esses passos.
Cubra deslize o slide e adicione esmalte preto ao redor das bordas para vedação. Seque no escuro e armazene-os a 4 graus Celsius. Abra uma cópia das pilhas desconvolved no software ImageJ carregado com plugin BioVoxxel.
Divida os canais clicando em Imagem, depois Cores e, em seguida, Canais Divididos. Mescle-os clicando em Imagem, depois Cores e, em seguida, Mesclar canais para atribuir cores diferentes. Converta a imagem em uma pilha de RGB clicando em Imagem e, em seguida, vá para Color e clique em Pilha para RGB.
Ajuste o brilho e o contraste clicando em Imagem, Ajuste e, em seguida, Brilho/Contraste. Use auto ou controle deslizante para garantir que as estruturas pré e pós-sináptica e as etiquetas internas das células ciliadas sejam distintas do plano de fundo. Rotule cinco células ciliares internas com a ferramenta de texto clicando no local desejado dentro da pilha.
Em seguida, vá para Analisar, em seguida, Ferramentas e selecione ROI Manager. Verifique as etiquetas da caixa de marcação para rotular os pontos com um número. Amplie a célula ciliada interna de interesse.
Clique com o botão direito do mouse na ferramenta ponto para escolher o modo de vários pontos. Role a dimensão Z e conte as sinapses de fita funcional, que são identificadas por uma fita pré-sináptica em justaposição a um patch de glutamato pós-sináptico. Depois de selecionar todas as estruturas de interesse, clique em Adicionar o Gerenciador de ROI e, em seguida, clique no nome arbitrário e escolha Renomear.
Com a ferramenta manual, ajuste a imagem para exibir completamente a próxima célula ciliada interna. Mude de ferramenta de vários pontos para ferramenta Ponto para evitar adicionar mais puncta aos dados armazenados anteriormente. Clique em uma estrutura de interesse dentro da próxima célula ciliada interna e mude para ferramenta de vários pontos.
Continue adicionando a sinapse da fita funcional no GERENCIADOr de ROI até que todas as células ciliadas internas sejam avaliadas. Clique em um conjunto de dados no Gerenciador de ROI e, em seguida, em Measure. Aguarde que uma nova janela apareça que liste os pontos de dados medidos e clique em Arquivo e Salvar Como salvar esta lista como uma planilha.
Salve a imagem ativando Show All no ROI Manager. Clique em Achatar para adicionar permanentemente as etiquetas de ponto à pilha e clique em Concordar em fechar salvando as alterações. Projeções de pilha de Z da cóclea de um jovem gerbil de 10 meses mostram que as células de cabelo interiores rotuladas myosin 7A delineadas aqui por linhas brancas tracejadas estavam em contraste acentuado com o fundo.
As fitas pré-sinápticas foram rotuladas com anti-CtBP2 duas mostradas em verde, enquanto as manchas de glutamato pós-sináptica foram rotuladas com anti-GluA2 mostrado em vermelho. A cóclea de um velho gerbil de 38 meses foi tratada com a quencher de autofluorescência e mostrou distintas células ciliadas internas com estruturas pré e pós-sinápticas claramente visíveis. Para testar a estabilidade do imunolabelamento, a mesma peça de cóclea do jovem gerbil foi imageda após três meses e 29 meses e meio.
Apesar da redução da relação sinal-ruído, as sinapses funcionais eram distintas e quantificáveis. Mesmo que um corte falhe, monte o pedaço restante de tecido para mais tarde estimar o comprimento coclear completo com mais precisão. Os dados deste protocolo são particularmente valiosos se precedidos por, e então individualmente correlacionados com testes eletrofisiológicos ou psicofísicos auditivos.
