Этот протокол позволяет оценить синаптическую целостность в улитке песчанки всех возрастов. Это важно для фундаментальных исследований проблем со слухом, в частности, из-за старения. Протокол относительно быстрый и дает количественные данные из нескольких мест вдоль улитки.
Кроме того, он решает конкретную проблему старения тканей с помощью автофлуоресцентного гасителя. Дегенерация синапсов является самым ранним признаком потери функции у улитки. Его количественная оценка является важным инструментом в исследованиях по разработке неинвазивных диагностических инструментов для синаптопатии.
Кохлеарная рассечение является наиболее важной частью, которая нуждается в практике, поэтому лучше начать с неэкспериментальных кохли. Начните с удаления булл. Разрежьте кость ножницами или сломайте кость щипцами и удалите ее щипцами, чтобы добраться до улитки.
Удалите маллеус, инкус и полукруглые каналы. Осторожно удалите кость, покрывающую верхушку улитки, и поцарапайте кохлеарную кость щипцами, чтобы сделать небольшие отверстия на вершине и в базальном повороте или осторожно проткните отверстия в обоих местах. Немедленно переведите буллы не менее чем в 50 миллилитров холодного фиксатора.
Чтобы разрезать кохли пополам, поместите кусок лезвия бритвы длиннее свернутой длины улитки в держатель лезвия. Затем поместите улитку в чашку Петри под стереомикроскоп. Отрежьте лишнюю ткань лезвием бритвы или тонкими ножницами.
Подержите улитку на месте тонкими щипцами и разрежьте пополам вдоль модиола. Приготовьте 5%-ный раствор автофлуоресцентного гасителя, смешав его с 70%-ным этанолом. Поместите кохли в этот раствор и инкубируйте его в течение одной минуты при комнатной температуре на шейкере с последующим трижды промыванием одним миллилитром PBS в течение пяти минут.
Для рассечения улитки соберите два тонких щипца, сверхтонкие щипцы, ванны, пружинные ножницы, держатель лезвия, лезвие бритвы и заполните полистироловую чашку Петри и ее крышку PBS. Отламывайте куски от лезвия бритвы, чтобы получить режущую поверхность от двух до четырех миллиметров. Разрежьте улитку пополам, как показано в разделе для подготовки тканей.
Аккуратно зафиксируйте кохлеарную половину щипцами так, чтобы срезанный край был обращен вверх. Используйте тонкие пружинные ножницы, чтобы отрезать кость улитки над хеликотремой, покрывающей верхушку. Затем используйте ножницы, чтобы изолировать апикальный поворот, разрезав модиолус и слуховой нерв и scala vestibuli.
Сделайте по два разреза с каждой стороны кохлеарной кости выше, или, если стрия васкулярная не нужна для дальнейшей оценки, непосредственно через сосудистую стрию среднего поворота. Используйте лезвие бритвы, чтобы отделить кохлеарные части. В качестве альтернативы можно разрезать между органом Корти и сосудистой стрией.
Оставьте стрии васкулярной соединенной со спиральной связкой и удалите декальцифицированную кость с помощью щипцов. Затем переложите кохлеарные кусочки в крышку чашки Петри, заполненную PBS. Удалите лишнюю ткань на стойке и модиолярных сторонах таким образом, чтобы все крепления впоследствии легли на горку как можно плаше.
Крупные кохлеарные куски, в частности, происходящие из базального поворота, следует разрезать на две части. Аккуратно удалите текториальную мембрану сверхтонкими щипцами. Поместите кохлеарные части на скольжение в каплю монтажной среды, убедившись, что орган Корти обращен вверх.
Переместите кохлеарный кусок в сагиттальную плоскость и ищите инвагинацию спирального лимбуса в непосредственной близости от внутренних волосковых клеток. Эта инвагинация спирального лимбуса более отчетливо видна в средних и базальных кохлеарных кусках. Перенесите всю улитку и всю васкулезную стрию на предметное стекло микроскопа, повторив эти шаги.
Накройте скольжение слайда и добавьте черный лак для ногтей по краям для уплотнения. Высушите в темноте и храните их при четырех градусах Цельсия. Откройте копию деконволюционных стеков в программном обеспечении ImageJ, загруженном плагином BioVoxxel.
Разделите каналы, щелкнув Изображение, затем Цвет, а затем Разделить каналы. Объедините их, щелкнув Изображение, затем Цвет, а затем Объединить каналы, чтобы назначить разные цвета. Преобразуйте изображение в стек RGB, щелкнув «Изображение», затем перейдите в «Цвет» и нажмите «Стек в RGB».
Отрегулируйте яркость и контрастность, щелкнув Изображение, Настроить, а затем Яркость/Контрастность. Используйте авто или ползунок, чтобы убедиться, что до- и постсинаптические структуры и внутренние метки волосковых клеток отличаются от фона. Пометьте пять внутренних волосковых ячеек с помощью текстового инструмента, щелкнув нужное место в стеке.
Затем перейдите в раздел Анализ, затем Инструменты и выберите Диспетчер окупаемости инвестиций. Установите флажки, чтобы пометить точки числом. Увеличьте масштаб интересующей внутренней волосковой клетки.
Щелкните правой кнопкой мыши инструмент «Точка», чтобы выбрать многоточечный режим. Прокрутите измерение Z и подсчитайте функциональные синапсы ленты, которые идентифицируются пресинаптической лентой в сопоставлении с постсинаптическим глутаматным пластырем. После выбора всех интересующих структур нажмите «Добавить менеджер ROI», затем нажмите на произвольное имя и выберите «Переименовать».
С помощью ручного инструмента отрегулируйте изображение, чтобы полностью отобразить следующую внутреннюю волосковую клетку. Перейдите с многоточечного инструмента на инструмент «Точка», чтобы избежать добавления дополнительных пунктов к ранее сохраненным данным. Нажмите на интересующую структуру в следующей внутренней волосковой клетке и перейдите на многоточечный инструмент.
Продолжайте добавлять функциональный синапс ленты в менеджер ROI до тех пор, пока не будут оценены все внутренние волосковые клетки. Щелкните набор данных в диспетчере ROI, а затем на Measure. Подождите, пока появится новое окно со списком измеренных точек данных, и нажмите «Файл» и «Сохранить как», чтобы сохранить этот список в виде электронной таблицы.
Сохраните изображение, активировав Show All в менеджере ROI. Нажмите на Flatten, чтобы окончательно добавить метки точек в стек, и нажмите кнопку Принять, чтобы закрыть, сохранив изменения. Проекции Z-стека из улитки молодой песчанки в возрасте 10 месяцев показывают, что меченые миозином 7А внутренние волосковые клетки, очерченные здесь белыми пунктирными линиями, резко контрастировали с фоном.
Пресинаптические ленты были помечены анти-CtBP2 двумя, показанными зеленым цветом, в то время как постсинаптические глутаматные пластыри были помечены анти-GluA2, показанным красным цветом. Улитка старой песчанки в возрасте 38 месяцев была обработана автофлуоресцентным гасителем и показала отчетливые внутренние волосковые клетки с четко видимыми пре- и постсинаптическими структурами. Чтобы проверить стабильность иммуномаркировки, тот же кусок улитки от молодой песчанки был сфотографирован через три месяца и 29 1/2 месяца.
Несмотря на уменьшенное отношение сигнал/шум, функциональные синапсы были отчетливыми и поддающимися количественной оценке. Даже если разрез не удается, установите оставшийся кусок ткани, чтобы позже оценить полную кохлеарную длину наиболее точно. Данные из этого протокола особенно ценны, если им предшествуют, а затем индивидуально коррелируют с электрофизиологическими или психофизическими тестами слуха.
