من شأن بروتوكولنا أن يسهل التحقيق في الهياكل العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات وهو أمر ضروري لفهم وظائف الدماغ بشكل أفضل. تمارس تقنية التطهير الخاصة بنا ، ScaleSF ، قدرة تطهير قوية ، بالإضافة إلى مستوى عال من الحفاظ على الأنسجة المطلوبة للتصور المتزامن لكل من الهياكل الكبيرة والصغيرة. بروتوكولنا فعال بشكل خاص في الدماغ حيث تظهر الخلايا العصبية عمليات معقدة وروابط هائلة وترتب هياكل تحت الخلايا الدقيقة المتخصصة.
قبل البدء في التجربة ، قم بإعداد حلول Sca / eS كما هو موضح في هذا الجدول وقم بتغطية العينات برقائق معدنية. ابدأ الإجراء بإضافة ثمانية ملليلترات لكل من حلول ScaleS0 و ScaleS4 إلى بئرين منفصلين من صفيحة زراعة خلايا البئر الستة وقم بتسخين الصفيحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. انقل شرائح الدماغ إلى محلول ScaleS0 المسخن مسبقا باستخدام ملعقة واحتضن الشرائح لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز عند 90 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك ، انقل شرائح الدماغ المتخلل في ثمانية ملليلترات من PBS ناقص في صفيحة زراعة خلايا من ستة آبار واغسلها لمدة 15 دقيقة عن طريق الاحتفاظ بها في اهتزاز مداري عند 40 إلى 60 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين. بعد ذلك ، انقل شرائح الدماغ في ثمانية ملليلترات من محلول ScaleS4 المسخن مسبقا واحتضنها لمدة ثماني إلى 12 ساعة عند 90 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
لإعداد الغرفة ، 3D طباعة إطار الغرفة ومحولات مرحلة المجهر. قم بتوصيل إطار الغرفة بغطاء باستخدام مادة لاصقة حساسة للضغط. تحضير 1.5٪ من الأغاروز في محلول ScaleS4D25 (0).
اخلطي المحلول وضعيه في الميكروويف حتى يذوب الأغاروز بالكامل. ثم اترك المحلول يبرد إلى 37 درجة مئوية. قم بتركيب شريحة الدماغ التي تم تطهيرها على الغطاء السفلي لغرفة التصوير باستخدام ملعقة.
قم بإزالة المحلول الزائد من الشريحة التي تم تطهيرها باستخدام منديل نظيف. أضف جل ScaleS4 إلى شريحة الدماغ باستخدام ماصة دقيقة لملء غرفة التصوير. ضع غطاء آخر في الأعلى باستخدام ملقط متبوعا بقطعة من المناديل الورقية وشريحة زجاجية.
انقل غرفة التصوير إلى الثلاجة عند أربع درجات مئوية. ضع أوزانا معدنية على الشريحة الزجاجية واتركها لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المادة من غرفة التصوير وامسح الجل الزائد.
ضع غرفة التصوير في طبق بتري زجاجي بحجم 60 ملم وقم بتوصيل حافة غرفة التصوير في نقاط متعددة بالطبق باستخدام مادة لاصقة حساسة للضغط. صب محلول ScaleS4 في الطبق ورجه بلطف لمدة ساعة واحدة عند 40 إلى 60 دورة في الدقيقة عند 20 إلى 25 درجة مئوية. استبدله بمحلول منعش وأزل فقاعات الهواء على سطح الجل عن طريق كشط السطح بلطف باستخدام طرف ماصة.
قم بتركيب غرفة التصوير على مرحلة المجهر. قم بإعداد مجهر مسح بالليزر البؤري مجهز بعدسة موضوعية متعددة الغمر بمسافة عمل 2.5 ملم وتكبير 16x وفتحة رقمية 0.60. قم بتشغيل جميع معدات التصوير ذات الصلة ، مثل محطة العمل والمجهر والماسح الضوئي والليزر ومصباح الزئبق وتشغيل برنامج تصوير.
اضبط طوق التصحيح للعدسة الموضوعية متعددة الغمر على 1.47. اغمر العدسة الموضوعية في المحلول واتركها تقترب من الشريحة ببطء. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء المحاصرة على طرف العدسة الموضوعية.
ابحث عن المناطق ذات الأهمية في الأنسجة التي تم تطهيرها باستخدام التألق اللاإرادي. لتعيين معلمات اكتساب الصورة، أولا، حدد عمق البت للحصول على الصورة مع زيادة حجم الصورة مع البت. ثم اضبط الطول الموجي للكشف وفقا لطيف الانبعاثات.
اضبط دقة XY وسرعة المسح الضوئي وحجم الثقب. اضبط أيضا طاقة الليزر ، وكسب مضخم الصوت الكاشف ، والإزاحة حتى يتم الحصول على صورة مناسبة. حدد حجم البلاط استنادا إلى حجم عائد الاستثمار، مما يضمن التقاط كامل طول وعرض عائد الاستثمار.
انتقل عبر الأنسجة في جميع المستويات واضبط نقاط البداية والنهاية للمكدس. اضبط حجم الخطوة Z، وفقا لدقة Z المطلوبة. جمع الصور ومعالجتها باستخدام برنامج تحليل الصور.
باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحقيق تطهير بصري لشريحة دماغ الفأر بسماكة ملليمتر واحد. أظهر تعبير EGFP في القشرة الدماغية للفئران PV-FGL أنه تم الحفاظ على التألق والسلامة الهيكلية للأنسجة. تسبب عدم تطابق معامل الانكسار الناجم عن الانحرافات في فقدان ملحوظ لسطوع الصورة ودقة الخلايا العصبية الإيجابية EGFP.
تم تصور هذه الخلايا العصبية بوضوح باستخدام المجهر الضوئي بالليزر البؤري عندما تم ضبط طوق التصحيح ليتناسب مع حل ScaleS4 هذا. تمت إعادة بناء 3D للخلايا العصبية المسماة EGFP في القشرة الحسية الجسدية الأولية للفأر في شريحة دماغية بسماكة ملليمتر واحد. شوهدت العرش الشجيرية الفردية المزينة بأشواك تغصنية في تكبير أعلى.
كما لوحظت في الشرائح تشجير المحطة الطرفية للمحور المحوري والبوتونات المحورية. تعد مطابقة المؤشر العاكس بين سائل التصوير وعدسة الكائن أمرا بالغ الأهمية للتصوير 3D في الأنسجة التي تم تطهيرها. من شأن تقنيتنا أن تسهل دمج بنية الخلايا العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات ، مما يوفر رؤى حول آليات الخلايا العصبية ، ومعلومات المعالجة في الدماغ.
