우리의 프로토콜은 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 필수적인 회로에서 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조에 대한 조사를 용이하게합니다. 당사의 클리어링 기술인 ScaleSF는 강력한 클리어링 기능뿐만 아니라 크고 작은 규모의 구조물을 동시에 시각화하는 데 필요한 높은 수준의 조직 보존을 발휘합니다. 우리의 프로토콜은 신경 세포가 정교한 과정, 엄청난 링크를 나타내며 전문화 된 미세한 세포 하부 구조를 배열하는 뇌에서 특히 효과적입니다.
실험을 시작하기 전에 이 표와 같이 Sca/eS 솔루션을 준비하고 샘플을 호일로 덮습니다. 여섯 웰 세포 배양 플레이트의 두 개의 분리된 웰에 각각 8밀리리터의 ScaleS0 및 ScaleS4 용액을 8밀리리터씩 첨가하여 절차를 시작하고 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도까지 미리 데온합니다. 뇌 조각을 주걱으로 미리 가온된 ScaleS0 용액으로 옮기고 90RPM의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 두 시간 동안 슬라이스를 인큐베이션합니다.
다음에, 투과된 뇌 절편을 6개의 웰 세포 배양 플레이트에서 마이너스 PBS 8밀리리터로 옮기고, 40 내지 60 RPM의 오비탈 진탕기에서 유지함으로써 15분 동안 세척한다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 그런 다음 뇌 조각을 미리 예열 된 ScaleS4 용액 8 밀리리터로 옮기고 섭씨 37도에서 90RPM에서 8 ~ 12 시간 동안 배양하십시오.
챔버 준비를 위해 챔버 프레임과 현미경 스테이지 어댑터를 3D 프린팅합니다. 감압 접착제를 사용하여 챔버 프레임을 커버슬립에 부착합니다. ScaleS4D25(0) 용액에서 1.5% 아가로스를 준비합니다.
용액을 혼합하고 아가로스가 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지를 돌립니다. 그런 다음 용액을 섭씨 37도까지 식히십시오. 클리어 된 뇌 조각을 주걱으로 이미징 챔버의 하단 커버 슬립에 장착하십시오.
깨끗한 조직을 사용하여 클리어 슬라이스에서 과량의 용액을 제거하십시오. ScaleS4 젤을 마이크로 피펫을 사용하여 뇌 조각에 추가하여 이미징 챔버를 채 웁니다. 포셉으로 위에 다른 커버 슬립을 놓고 티슈 페이퍼와 유리 슬라이드를 놓습니다.
이미징 챔버를 섭씨 네 도의 냉장고로 옮깁니다. 유리 슬라이드에 금속 무게를 놓고 30 분 동안 그대로 두십시오. 인큐베이션 후, 이미징 챔버로부터 물질을 제거하고 과량의 겔을 닦아낸다.
이미징 챔버를 60mm 유리 페트리 접시에 넣고 이미징 챔버의 테두리를 여러 지점에 감압 접착제로 접시에 부착하십시오. ScaleS4 용액을 접시에 붓고 섭씨 20 ~ 25도에서 40 ~ 60 RPM으로 한 시간 동안 부드럽게 흔들어줍니다. 신선한 용액으로 대체하고 피펫 팁을 사용하여 표면을 부드럽게 긁어 젤 표면의 기포를 제거하십시오.
이미징 챔버를 현미경 스테이지에 장착하십시오. 2.5 밀리미터 작동 거리, 16x 배율 및 0.60 수치 조리개의 다중 침지 대물 렌즈가 장착 된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 준비하십시오. 워크 스테이션, 현미경, 스캐너, 레이저, 수은 램프와 같은 모든 관련 이미징 장비를 켜고 이미징 소프트웨어를 시작하십시오.
다중 침지 대물 렌즈의 보정 칼라를 1.47로 설정합니다. 대물 렌즈를 용액에 담그고 슬라이스에 천천히 접근하게하십시오. 대물 렌즈 끝에 갇힌 모든 기포를 제거하십시오.
epifluorescence를 사용하여 클리어 된 조직에서 관심있는 영역을 찾으십시오. 이미지 획득 파라미터를 설정하려면, 먼저, 비트에 따라 이미지의 크기가 증가함에 따라 이미지 획득을 위한 비트 깊이를 결정한다. 그런 다음 방출 스펙트럼에 따라 검출 파장을 설정하십시오.
XY 해상도, 스캔 속도 및 핀홀 크기를 설정합니다. 또한 레이저 전력, 검출기 증폭기 이득 및 적절한 이미지가 얻어질 때까지 오프셋을 조정한다. ROI의 크기에 따라 타일링 크기를 결정하여 ROI의 전체 길이와 너비가 캡처되도록 합니다.
모든 평면에서 조직을 탐색하고 스택의 시작과 끝점을 설정합니다. 원하는 Z 해상도에 따라 Z 단계 크기를 설정합니다. 이미지를 수집하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 처리합니다.
이 프로토콜을 사용하여, 한 밀리미터 두께의 마우스 뇌 슬라이스의 광학 클리어링이 달성되었다. PV-FGL 마우스의 대뇌 피질에서의 EGFP 발현은 조직의 형광 및 구조적 완전성이 보존되었음을 보여주었다. 굴절률 불일치 유도 수차는 EGFP 양성 뉴런의 이미지 밝기 및 해상도의 현저한 손실을 야기하였다.
이 뉴런은 보정 칼라가이 ScaleS4 솔루션과 일치하도록 조정되었을 때 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 명확하게 시각화되었습니다. 마우스 일차 체감각 피질에서 EGFP 표지된 뉴런의 3D 재구성은 한 밀리미터 두께의 뇌 절편에서 이루어졌다. 수지상 척추로 장식 된 개별 수지상 arbors는 더 높은 배율로 보였다.
축삭 말단 수목화 및 축삭 부톤도 슬라이스에서 관찰되었다. 이미징 유체와 오브젝트 렌즈 사이의 반사 지수 정합은 클리어링된 조직에서 3D 이미징에 매우 중요합니다. 우리의 기술은 회로에서 구성 요소 스케일에 이르기까지 뉴런 구조를 통합하는 것을 촉진하여 뉴런 메커니즘에 대한 통찰력, 뇌에서의 처리 정보를 제공합니다.
