一种从介观尺度到微观尺度的神经元成像组织清除方法

我们的协议将促进从电路到组件尺度的神经元结构的研究，这对于更好地理解大脑功能至关重要。我们的清除技术，ScaleSF发挥了强大的清除能力，以及同时可视化大型和小型结构所需的高水平组织保存。我们的方案在大脑中特别有效，其中神经元细胞表现出复杂的过程，巨大的联系，并安排专门的精细亚细胞结构。

在开始实验之前，如本表所示，制备Sca / eS溶液并用箔覆盖样品。通过将ScaleS0和ScaleS4溶液各八毫升添加到六孔细胞培养板的两个独立孔中，并在培养箱中将板预热至37摄氏度来开始该过程。用刮刀将脑切片转移到预热的ScaleS0溶液中，并在37摄氏度下以90 RPM的振荡培养箱中将切片孵育两小时。

接下来，将透化的脑切片转移到八毫升PBS减去六孔细胞培养板中，并通过保持在40至60 RPM的轨道振荡器中洗涤15分钟。重复此步骤两次。然后，将脑切片转移到8毫升预热的ScaleS4溶液中，并在37摄氏度下以90 RPM孵育8至12小时。

对于腔室制备，3D打印腔室框架和显微镜载物台适配器。使用压敏粘合剂将腔室框架连接到盖玻片上。在ScaleS4D25（0）溶液中制备1.5%琼脂糖。

混合溶液并用微波炉加热，直到琼脂糖完全溶解。然后让溶液冷却至37摄氏度。用刮刀将清除的脑切片安装到成像室的底部盖玻片上。

使用干净的组织从清除的切片中取出多余的溶液。使用微量移液管将ScaleS4凝胶添加到脑切片中以填充成像室。用镊子在上面放另一个盖玻片，然后用一张纸巾和一张载玻片。

将成像室转移到四摄氏度的冰箱中。将金属砝码放在载玻片上，静置 30 分钟。孵育后，从成像室中取出材料并擦去多余的凝胶。

将成像室置于60毫米玻璃培养皿中，并用压敏粘合剂将成像室的边缘在多个点上连接到培养皿上。将ScaleS4溶液倒入培养皿中，在20至25摄氏度下以40至60 RPM温和摇动一小时。用新鲜溶液代替，并使用移液器吸头轻轻刮擦表面以去除凝胶表面上的气泡。

将成像室安装在显微镜载物台上。准备一台共聚焦激光扫描显微镜，配备工作距离为2.5毫米，放大倍率为16倍，数值孔径为0.60的多浸入物镜。打开所有相关的成像设备，如工作站、显微镜、扫描仪、激光器、汞灯，然后启动成像软件。

将多浸入式物镜的校正环设置为1.47。将物镜浸入溶液中，让它慢慢接近切片。清除物镜尖端的所有气泡。

使用落射荧光在清除的组织中查找感兴趣的区域。要设置图像采集参数，首先，确定图像采集的位深度，因为图像的大小随着位的增加而增加。然后根据发射光谱设置检测波长。

设置 XY 分辨率、扫描速度和针孔大小。还要调整激光功率、检测器放大器增益和偏移，直到获得合适的图像。根据 ROI 的大小确定平铺大小，确保捕获 ROI 的整个长度和宽度。

在所有平面中的组织中导航，并设置堆栈的起点和终点。根据所需的 Z 分辨率设置 Z 步长。收集图像并使用图像分析软件进行处理。

使用该协议，实现了一毫米厚度的小鼠脑切片的光学清除。EGFP在PV-FGL小鼠大脑皮层中的表达表明，组织的荧光和结构完整性得以保留。折射率失配引起的像差导致EGFP阳性神经元的图像亮度和分辨率的明显损失。

当调整校正环以匹配此ScaleS4溶液时，用共聚焦激光扫描显微镜清楚地观察这些神经元。在一毫米厚的脑切片中完成小鼠初级躯体感觉皮层中EGFP标记神经元的3D重建。在更高的放大倍率下可以看到装饰有树突状棘的单个树突状乔木。

在切片中还观察到轴突末端树艺化和轴突柱突。成像流体和物体透镜之间的反射指数匹配对于清除组织中的3D成像至关重要。我们的技术将有助于将神经元结构从电路整合到组件尺度，提供对神经元机制的见解，大脑中的处理信息。