Notre protocole faciliterait l’étude des structures neuronales, du circuit à l’échelle des composants, ce qui est essentiel pour une meilleure compréhension des fonctions cérébrales. Notre technique de nettoyage, ScaleSF, exerce une puissante capacité de nettoyage, ainsi qu’un haut niveau de préservation des tissus requis pour la visualisation simultanée de structures à grande et à petite échelle. Notre protocole est particulièrement efficace dans le cerveau où les cellules neuronales présentent des processus élaborés, des liens énormes et organisent des structures subcellulaires fines spécialisées.
Avant de commencer l’expérience, préparez les solutions Sca/eS comme indiqué dans ce tableau et couvrez les échantillons avec du papier d’aluminium. Commencez la procédure en ajoutant huit millilitres de solutions ScaleS0 et ScaleS4 à deux puits distincts d’une plaque de culture cellulaire de six puits et préchauffez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur. Transférer les tranches de cerveau dans la solution ScaleS0 préchauffée avec une spatule et incuber les tranches pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à agitation à 90 RPM.
Ensuite, transférez les tranches de cerveau perméabilisées dans huit millilitres de PBS moins dans une plaque de culture cellulaire de six puits et lavez-les pendant 15 minutes en les maintenant dans un agitateur orbital à 40 à 60 tr / min. Répétez cette étape deux fois. Ensuite, transférez les tranches de cerveau dans huit millilitres de solution ScaleS4 préchauffée et incubez pendant huit à 12 heures à 90 tr / min à 37 degrés Celsius.
Pour la préparation de la chambre, imprimez en 3D le cadre de la chambre et les adaptateurs d’étage de microscope. Fixez le cadre de la chambre à un couvercle à l’aide d’un adhésif sensible à la pression. Préparer 1,5 % d’agarose dans la solution ScaleS4D25(0).
Mélanger la solution et la mettre au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Laissez ensuite refroidir la solution à 37 degrés Celsius. Montez la tranche de cerveau dégagée sur le couvercle inférieur de la chambre d’imagerie à l’aide d’une spatule.
Retirez l’excès de solution de la tranche nettoyée à l’aide d’un mouchoir propre. Ajoutez le gel ScaleS4 à la tranche de cerveau à l’aide d’une micropipette pour remplir la chambre d’imagerie. Placez un autre couvercle sur le dessus avec des pinces suivies d’un morceau de papier de soie et d’une glissière en verre.
Transférer la chambre d’imagerie dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Placez des poids métalliques sur la glissière en verre et laissez-les pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le matériau de la chambre d’imagerie et essuyez l’excès de gel.
Placez la chambre d’imagerie dans une boîte de Petri en verre de 60 millimètres et fixez le bord de la chambre d’imagerie en plusieurs points à la boîte avec un adhésif sensible à la pression. Versez la solution ScaleS4 dans le plat et secouez doucement pendant une heure à 40 à 60 RPM à 20 à 25 degrés Celsius. Remplacer par une solution fraîche et éliminer les bulles d’air sur la surface du gel en grattant doucement la surface à l’aide d’une pointe de pipette.
Montez la chambre d’imagerie sur une scène de microscope. Préparez un microscope confocal à balayage laser équipé d’une lentille d’objectif multi-immersion de 2,5 millimètres de distance de travail, d’un grossissement 16x et d’une ouverture numérique de 0,60. Allumez tous les équipements d’imagerie pertinents, tels que le poste de travail, le microscope, le scanner, les lasers, la lampe au mercure et lancez un logiciel d’imagerie.
Réglez le collier de correction de l’objectif multi-immersion sur 1,47. Immergez la lentille de l’objectif dans la solution et laissez-la s’approcher lentement de la tranche. Retirez toutes les bulles d’air piégées sur la pointe de l’objectif.
Trouvez des régions d’intérêt dans les tissus nettoyés en utilisant l’épifluorescence. Pour définir les paramètres d’acquisition d’image, déterminez d’abord la profondeur de bits pour l’acquisition d’image à mesure que la taille de l’image augmente avec le bit. Réglez ensuite la longueur d’onde de détection en fonction du spectre d’émission.
Définissez la résolution XY, la vitesse de numérisation et la taille du sténopé. Ajustez également la puissance du laser, le gain de l’amplificateur du détecteur et le décalage jusqu’à ce qu’une image appropriée soit obtenue. Déterminez la taille du carrelage en fonction de la taille du retour sur investissement, en veillant à ce que toute la longueur et la largeur du retour sur investissement soient capturées.
Naviguez dans le tissu dans tous les plans et définissez le début et les extrémités de la pile. Définissez la taille de l’étape Z, en fonction de la résolution Z souhaitée. Collectez les images et traitez-les à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
En utilisant ce protocole, le nettoyage optique d’une tranche de cerveau de souris d’un millimètre d’épaisseur a été réalisé. L’expression de l’EGFP dans le cortex cérébral des souris PV-FGL a montré que la fluorescence et l’intégrité structurelle des tissus étaient préservées. Les aberrations induites par l’inadéquation de l’indice de réfraction ont provoqué une perte notable de luminosité de l’image et de résolution des neurones EGFP positifs.
Ces neurones ont été clairement visualisés avec le microscope à balayage laser confocal lorsque le collier de correction a été ajusté pour correspondre à cette solution ScaleS4. La reconstruction 3D des neurones marqués EGFP dans le cortex somatosensoriel primaire de la souris a été réalisée dans une tranche de cerveau d’un millimètre d’épaisseur. Des tonnelles dendritiques individuelles décorées d’épines dendritiques ont été observées à un grossissement plus élevé.
Une arborisation terminale axonale et des boutons axonal ont également été observés dans les tranches. L’appariement de l’indice réfléchissant entre le fluide d’imagerie et la lentille objet est essentiel pour l’imagerie 3D dans les tissus nettoyés. Notre technique faciliterait l’intégration de la structure des neurones du circuit aux échelles des composants, en fournissant des informations sur les mécanismes des neurones, des informations de traitement dans le cerveau.
