Nosso protocolo facilitaria a investigação de estruturas neuronais de circuitos a escalas de componentes, o que é essencial para uma melhor compreensão das funções cerebrais. Nossa técnica de compensação, ScaleSF exerce potente capacidade de compensação, bem como um alto nível de preservação tecidual que é necessário para visualização simultânea de estruturas de grande e pequena escala. Nosso protocolo é especialmente eficaz no cérebro onde as células neuronais exibem processos elaborados, ligações tremendas e organizam estruturas subcelulares especializadas.
Antes de iniciar o experimento, prepare as soluções Sca/eS, como mostrado nesta tabela e cubra as amostras com papel alumínio. Inicie o procedimento adicionando oito mililitros cada uma das soluções ScaleS0 e ScaleS4 a dois poços separados de uma placa de cultura de seis poços e pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora. Transfira as fatias cerebrais para a solução ScaleS0 pré-aquecida com uma espátula e incuba as fatias por duas horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de agitação a 90 RPM.
Em seguida, transfira as fatias cerebrais permeabilizadas em oito mililitros de PBS menos em uma placa de cultura de seis poços e lave por 15 minutos mantendo-se em um agitador orbital a 40 a 60 RPM. Repita este passo duas vezes. Em seguida, transfira as fatias cerebrais em oito mililitros de solução ScaleS4 pré-aquecida e incubar por oito a 12 horas a 90 RPM a 37 graus Celsius.
Para preparação da câmara, imprima em 3D o quadro da câmara e os adaptadores do estágio do microscópio. Conecte o quadro da câmara a uma mancha de cobertura usando um adesivo sensível à pressão. Prepare 1,5% de agarose na solução ScaleS4D25(0)..
Misture a solução e micro-ondas até que a agarose esteja totalmente dissolvida. Em seguida, deixe a solução esfriar a 37 graus Celsius. Monte a fatia do cérebro limpa na tampa inferior da câmara de imagem com uma espátula.
Remova a solução em excesso da fatia limpa usando um tecido limpo. Adicione o gel ScaleS4 à fatia cerebral usando uma micropipette para encher a câmara de imagem. Coloque outra mancha de cobertura em cima com fórceps seguidos de um pedaço de papel de tecido e um slide de vidro.
Transfira a câmara de imagem para uma geladeira a 4 graus Celsius. Coloque pesos metálicos no deslizamento de vidro e deixe-os por 30 minutos. Após a incubação, remova o material da câmara de imagem e limpe o excesso de gel.
Coloque a câmara de imagem em uma placa de Petri de vidro de 60 milímetros e conecte a borda da câmara de imagem em vários pontos à placa com um adesivo sensível à pressão. Despeje a solução ScaleS4 no prato e agite suavemente por uma hora a 40 a 60 RPM a 20 a 25 graus Celsius. Substitua com uma solução fresca e remova bolhas de ar na superfície do gel raspando suavemente a superfície usando uma ponta de pipeta.
Monte a câmara de imagens em um palco de microscópio. Prepare um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma lente objetiva multi-imersão de 2,5 milímetros de distância de trabalho, ampliação de 16x e abertura numérica de 0,60. Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes, como a estação de trabalho, microscópio, scanner, lasers, lâmpada de mercúrio e lance um software de imagem.
Coloque a coleira de correção da lente objetiva de multi-imersão para 1,47. Mergulhe a lente objetiva na solução e deixe-a aproximar-se lentamente da fatia. Remova todas as bolhas de ar presas na ponta da lente objetiva.
Encontre regiões de interesse em tecidos limpos usando epifluorescência. Para definir os parâmetros de aquisição de imagens, primeiro, determine a profundidade de bit para aquisição de imagem à medida que o tamanho da imagem aumenta com o bit. Em seguida, defina o comprimento de onda de detecção de acordo com o espectro de emissões.
Defina a resolução XY, a velocidade de varredura e o tamanho do pinhole. Ajuste também a potência do laser, o ganho do amplificador do detector e o deslocamento até que uma imagem adequada seja obtida. Determine o tamanho do revestimento com base no tamanho do ROI, garantindo que todo o comprimento e largura do ROI sejam capturados.
Navegue pelo tecido em todos os planos e defina os pontos de partida e os pontos finais da pilha. Defina o tamanho da etapa Z, de acordo com a resolução Z desejada. Colete as imagens e processe-as usando software de análise de imagem.
Usando este protocolo, foi alcançada a limpeza óptica de uma fatia cerebral do rato de uma espessura milimétrica. A expressão EGFP no córtex cerebral dos camundongos PV-FGL mostrou que a fluorescência e a integridade estrutural dos tecidos foram preservadas. As incompatibilidades de índices refrativos induzidas causaram uma perda notável de brilho da imagem e resolução de neurônios positivos EGFP.
Esses neurônios foram claramente visualizados com o microscópio de varredura a laser confocal quando a coleira de correção foi ajustada para corresponder a esta solução ScaleS4. A reconstrução 3D dos neurônios rotulados por EGFP no córtex somatosensorial primário do camundongo foi feita em uma fatia cerebral de um milímetro de espessura. Arboris dendráticos individuais decorados com espinhas dendríticas foram vistos em maior ampliação.
Arborização terminal axon e boutons axonal também foram observados nas fatias. A correspondência de índice reflexivo entre fluido de imagem e lente de objeto é fundamental para imagens 3D em tecidos limpos. Nossa técnica facilitaria a integração da estrutura dos neurônios do circuito às escalas de componentes, fornecendo insights sobre mecanismos de neurônios, informações de processamento no cérebro.
